Damos las gracias a Susan Gerbi, Heidi Smith, y David Lambert para el suministro de material a prueba in-vivo centrifugación en Sciara coprophila y obsoleta Ilyanassa, respectivamente. Agradecemos a los miembros del laboratorio de Welte para comentarios sobre la técnica y el manuscrito. Desarrollo y el perfeccionamiento de la prueba de centrifugación en vivo fue apoyada por NIGMS conceder GM64687 para el PMA. Las imágenes mostradas en la figura. 1 y la figura. 5E, F se publicó anteriormente con el 2 y se reproduce aquí con permiso.

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	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

Los pasos críticos Asegúrese de que la concentración de agar es lo suficientemente alto. Si es demasiado baja, el agar se desintegra durante la centrifugación, y los embriones va a estallar o ser orientadas al azar. Si la concentración de agar es sólo un poco demasiado bajo o si el agar es húmeda (extracción suficientemente seca o insuficiente de los servicios de apoyo técnico en exceso en el paso 4.3), los embriones se saldrán de sus agujeros durante la centrifugación y se convierten en mal orientada. Si el agar se vierte demasiado fino, también se derrumbará o crack durante el centrifugado. Asegúrese de que los embriones no han avanzado más allá de las etapas cellularization. De lo contrario, la separación de los orgánulos no va a funcionar (Fig. 5C), ya que se convertirá en orgánulos secuestrado dentro de miles de células individuales. En los embriones más jóvenes en la etapa de célula, los orgánulos son libres para migrar grandes distancias y se acumulan de acuerdo a su densidad característica. Para evitar el análisis de embriones que son demasiado viejos, asegúrese de que (i) incluye una colección pre-para permitir que las hembras para depositar sus huevos viejos (paso 2.4), (ii) recoger los embriones durante 3 horas o menos (paso 2.5), (iii) seleccionar visualmente los embriones antes de las etapas cellularization para integrarse en agar (paso 4.2), (iv) mantener incorporación de corto tiempo para prevenir el desarrollo hasta el final de cellularization (paso 4.6), y (v) desechar los embriones que no la capa de forma correcta (paso 5.6) . No escatime en el tiempo de centrifugación. Aunque algunos de los embriones muestran capas bien incluso después de sólo 10 minutos de centrifugación, la separación no es coherente desde el embrión al embrión. 30 vueltas min dar resultados muy consistentes. Además, cuanto mayor sea el tiempo de centrifugación, el más largo de las capas se mantienen estables después de la centrifugación ha terminado. Esto es importante para aquellas aplicaciones en las que se necesita tiempo para procesar los embriones más antes de su uso (por ejemplo, si es que necesitan ser procesados ​​para los experimentos de trasplante o montados para el análisis confocal). Posibles modificaciones Recolección de huevos y eliminación de los diferentes protocolos de corion existen muchos de los pasos 2 y 3 1, 3, 9, y el trabajo, así como los aquí descritos, siempre y cuando los embriones utilizados son los jóvenes, la producción de huevo es alta, y la fracción del mis- embriones escena se reduce al mínimo. Antero-posterior alineamiento El protocolo orienta todos los embriones de tal manera que el extremo posterior está enterrado en el agar y el extremo anterior es hacia arriba (Fig. 3). Esta orientación es buena para mantener la coherencia, de modo que es posible utilizar el micrópilo como un hito que terminan apuntando hacia arriba durante la centrifugación (Fig. 1, 5). Sin embargo, con la práctica, es fácil detectar la orientación de los embriones de centrifugado por la aparición de los distintos lípidos gota y las capas de yema de huevo por el microscopio de campo brillante. Entonces se convierte en la posibilidad de montar los embriones, ya sea con terminar, esta flexibilidad se acelera el proceso de montaje. Centrifugación desorientada El aspecto más tiempo y es técnicamente desafiante del protocolo es el montaje de los embriones en agar (paso 4). Se requiere tocar cada embrión en dos ocasiones (una vez que lo inserte en el agujero y una vez que se recuperan después de centrifugación). Como alternativa, se puede transferir los embriones en el paso 4.1 en tubos de microcentrífuga lleno de TSS. Cuando estos tubos se centrifugan en una microcentrífuga (13.000 rpm, 10-30 min), los embriones también suelen capa y 10-13. Esta variación permite procesar cientos de embriones a la vez muy rápidamente. Sin embargo, la estratificación no es tan consistente, una fracción de los embriones no se desarrolla de distintas capas a pesar de las fuerzas de centrifugación mucho mayor (~ 16 000 g) que aplica en el protocolo anterior. Más problemático es el hecho de que la orientación de los embriones es variable, y se puede observar la separación en distintos ángulos con respecto al eje principal del embrión. Esta variabilidad requiere el investigador para clasificar después de la centrifugación como un embrión en particular, se organizó en el tubo de centrífuga. Con el uso de la autofluorescencia yema como un marcador para la parte más densa del embrión, esto es a menudo posible, aunque requiere mucha práctica y más juicio para hacerlo de forma fiable. Si hay embriones suficiente en la muestra, uno puede ser capaz de resolver los casos en que los embriones que pasó a ser dispuestos como en la figura. 1. Centrifugación de los embriones en su cáscara de huevo es posible incluir los embriones en agar para el paso 4 sin necesidad de retirar el corion 2 primeros. En este enfoque, los embriones en la placa de la colección están cubiertos con aceite de halocarbonos en lugar de 50% de lejía en el paso 3.2 (halocarbonos se vuelve transparente el corion). Embriones de las etapas apropiadas se seleccionan y se transfieren a una placa de agar con unas pinzas nuevas, sólo por el acaparamiento de los filamentos de huevo con las pinzas, el daño ael embrión adecuado se evita. Los embriones están inmersos en el paso 4.4 hasta 4.8, con los filamentos de huevo anterior que sobresale de el agujero en el agar. La cáscara del huevo se elimina por tratamiento con lejía al 50% después de que los embriones han sido centrifugado y excavado en el agar como en el paso 5.4. Centrifugación en presencia de la cáscara de huevo puede mejorar la tasa de devitellinization después de la fijación (paso 6.2), pero la selección de las etapas de centrifugación correcta (paso 4.2) es más difícil. Aplicaciones Centrifugación embrión es particularmente útil para los experimentos de colocalización, es decir, para probar si una proteína se localiza en un determinado orgánulos más importantes. Por ejemplo, la proteína está presente en Klar principios de gotas de lípidos embrionarias, sin embargo, esta localización es difícil de demostrar en los embriones intactos. En parte, esto se debe a que tanto Klar puntos lagrimales y las gotas de lípidos son abundantes en la periferia del embrión 10, por lo que colocalización duro para descartar falsos. Sin embargo, la centrifugación concentra las gotas de lípidos en una capa distinta, y por lo tanto, colocalización con la señal de Klar se hace evidente 10. Un análisis similar se ha demostrado de manera inequívoca la localización de las otras proteínas a 8 gotas de lípidos, 13-15, con ejemplos sorprendentes como las histonas ciertos 2 y en los casos en que una proteína está presente por doquier, pero enriquecido por las gotas de lípidos 8. Los embriones se pueden seleccionar visualmente la etapa de desarrollo (paso 4.2), es posible la determinación de la contratación desarrollo regulado de proteínas a 8 gotas de lípidos, 15. Las pruebas de colocalización con las gotas de lípidos es muy fácil, ya que las gotas de lípidos se acumulan en una diferencia visual de &quot;tope&quot;, por lo que ningún marcador más o mancha se requiere para identificar a esta capa. De hecho, debido a su facilidad y resultados visuales potencialmente sorprendentes (Fig. 1, fig. 5 D, E), el laboratorio emplea esta técnica de manera rutinaria como la primera prueba si un candidato proteína se localiza en las gotas de lípidos. En principio, los estudios similares colocalización debe trabajar para los orgánulos que se muestran en la figura. 1, y es probable que para otros (incluyendo parásitos intracelulares), cuya distribución en los embriones de centrifugado aún no se ha documentado. Desde la centrifugación se concentra en los organelos bandas apretadas, que facilita el aislamiento de una fracción enriquecida en estos orgánulos. Este enfoque ya ha sido utilizado para recuperar las gotas de lípidos para el trasplante en dos embriones de donantes. También puede ser posible analizar bioquímicamente la fracción enriquecida (por ejemplo, mediante la reducción de las capas de embriones después de la fijación 15). El método descrito aquí tiene aplicaciones más allá de embriones de Drosophila, como la centrifugación puede ser usado para estratificar a los huevos de diferentes especies (incluyendo ranas, nematodos, tunicados, anélidos, erizos de mar, moluscos, cnidarios y) 16. En nuestro propio laboratorio, se ha utilizado el protocolo anterior para los embriones de la mosca doméstica Musca domestica 2 y han utilizado la centrifugación no orientado en el análisis de los embriones de los hongos mosquito Sciara coprophila 17 y el caracol Ilyanassa obsoleta 17. Finalmente, este método no se limita a los embriones: La centrifugación también puede ser útil para estratificar a otras células grandes, como los ovocitos (por ejemplo, en Drosophila 2, 18 y el algodoncillo error Oncopeltus fasciatus 17). Para el modelo diferentes, las condiciones de centrifugación exacta necesita ser optimizado: Por ejemplo, 10 minutos a 3000 g es suficiente para estratificar de manera eficiente los embriones de Musca domestica 2, y si se centrifuga mucho más tiempo, los embriones tienden a separarse durante la fijación y tinción.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Una estrategia importante para la purificación y aislamiento de los diferentes tipos de organelos intracelulares es separarlos unos de otros sobre la base de diferencias en la densidad de flotación. Sin embargo, cuando las células se rompen antes de la centrifugación, las proteínas y orgánulos en este entorno no-nativos a menudo inadecuadamente pegan unas a otras. Aquí se describe un método para separar organelos por la densidad de intacto, viviendo embriones de Drosophila. Principios de los embriones antes de cellularization se cosechan a partir de las jaulas de la población, y sus cáscaras de huevo exterior se eliminan mediante el tratamiento con 50% de lejía. Los embriones se transfieren a una placa de agar pequeña y se inserta, extremo posterior en primer lugar, en pequeños agujeros verticales en el agar. Las placas que contienen embriones incrustado se centrifugan durante 30 min a 3000g. El agar soporta los embriones y los mantiene en una orientación definida. Posteriormente, los embriones son extraídos del agar con una aguja de punta roma. Centrifugación separa orgánulos importantes en distintas capas, una estratificación fácilmente visible por el microscopio de campo brillante. Una serie de marcadores fluorescentes están disponibles para confirmar la estratificación éxito en embriones vivos. Proteínas asociadas con ciertos orgánulos se verá enriquecido en una capa de concreto, lo que demuestra colocalización. Las capas individuales pueden ser recuperados para su análisis bioquímicos o trasplante en la donación de óvulos. Esta técnica es aplicable para la separación de orgánulos en otras células grandes, incluyendo los huevos y los ovocitos de diversas especies.

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Se describe un método para separar los orgánulos de la densidad en la vida<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones. Los embriones están inmersos en agar y se centrifuga. Esta técnica produce la separación reproducible de los organelos importantes a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Este método facilita la colocalización experimentos y las fracciones de los rendimientos de orgánulos para el análisis bioquímico y experimentos de trasplante.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K vistas.  University of Rochester. Se describe un método para separar los orgánulos de la densidad en la vida Drosophila Embriones. Los embriones están inmersos en agar y se centrifuga. Esta técnica produce la separación reproducible de los organelos importantes a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Este método facilita la colocalización experimentos y las fracciones de los rendimientos de orgánulos para el análisis bioquímico y experimentos de trasplante.