LHB fue financiado por el programa de doctorado de la célula Wellcome Trust dinámico; KAR fue financiado por la subvención del proyecto MRC MR / L002566 / 1 (otorgado a EJR y CLH) y CLH fue financiado por Aruk subvención 19479. También nos gustaría dar las gracias a la instalación de Wolfson Bioimagen para el asesoramiento de imagen.

Todos los pasos dentro del protocolo siguen la Universidad de cuidado de los animales de Bristol y directrices para el bienestar y los del Ministerio del Interior del Reino Unido. 1. La visualización de la anatomía musculoesquelética NOTA: Para visualizar la forma de los elementos esqueléticos, para cuantificar el músculo y para identificar la ubicación exacta de las inserciones musculares, immunostain (sección 1.1) de pescado a la edad apropiada para la miosina esquelética (que revela muscular) y colágeno tipo II (para visualizar cartílago). Alternativamente, visualizar la anatomía musculoesquelético usando líneas indicadoras fluorescentes transgénicos tales como el colágeno COL2A1 reportero a1: mCherry 13,14 para visualizar el cartílago y la miosina lenta cadena pesada smyhc reportero: GFP 15 para visualizar la posición de las inserciones musculares (Sección 1.2). líneas alternativas que marcan el cartílago y músculo podrían funcionar igualmente bien. <ol><li> fluorescente Immunostacaniza <ol><li> Fijar larva en exceso de 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hr. Lavar en PBS con 0,1% de Tween 20 (PBT) y deshidratar en 50% de metanol (MeOH) en PBT y 100% de MeOH durante 5 min, respectivamente. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manejado de acuerdo con la hoja de seguridad de materiales. NOTA: Larva se puede almacenar en 100% de MeOH hasta que se requiera. </li><li> Rehidratar larva en 50% de MeOH en PBT durante 5 min. Lavar en PBT durante 5 min. </li><li> Permeabilizar la larva en tripsina al 0,25% en PBT en hielo durante 5-6 minutos. Lavar con 4x PBT durante 5 minutos cada uno. </li><li> Bloquear durante 2-3 horas en 5% de suero en PBT. </li><li> Incubar larva en la dilución recomendada de conejo anti-tipo 2 del colágeno y los anticuerpos anti-miosina de ratón en 5% de suero en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. NOTA: El intervalo de dilución recomendada es normalmente en la hoja de datos de anticuerpos. Elija anticuerpos que se plantean frente a diferentes especies entre sí y que también son difealquilar al tejido. </li><li> Lavar 6x larva durante 15 minutos en PBT. </li><li> Bloquear durante 1-2 horas en 5% de suero en PBT. </li><li> Incubar en anticuerpos secundarios en la oscuridad. Utilice la etiqueta fluorescente anti-ratón (550) y anti-conejo (488) secundaria de anticuerpos a una dilución apropiada en 5% de suero y PBT para el anticuerpo específico. </li><li> Lavar 6 veces durante 10 minutos cada uno en PBT y la imagen en un microscopio confocal de 10 veces, tan pronto como sea posible. </li></ol></li><li> Geometría de imágenes musculoesqueléticos <ol><li> Montar las larvas ventral en un cubreobjetos de agarosa al 0,3-0,5% tibia bajo punto de fusión (LMP) en solución de Danieau 16. NOTA: Los peces transgénicos tendrá que ser sedado en 0,02% MS222 (Tricaína metanosulfonato, pH 7) antes del montaje y durante la exploración. </li><li> Tome una pila de imágenes confocal de la región de interés utilizando la lente objetivo de 10X y el zoom digital de aproximadamente 2,5 veces. Preparar las imágenes del canal verde y rojo usando los 488 nm y 561 nm láseres respectivamente. Imagen con una resolución de píxeles 512 x 512 con un intervalo entre los planos z de 1,3 micras y 3 promedios de línea. La pila resultante comprenderá de aproximadamente 100 rodajas z. </li><li> Exportar los datos como una serie tiff. Proyecciones de máxima de los elementos de músculo y cartílago de una larva de pez cebra 5dpf se muestran en la Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Generación de una superficie 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Elija un conjunto de datos representativo para cada punto de tiempo a los 3, 4 y 5 dpf (elija después de la visualización de múltiples muestras). </li><li> Abrir pila tiff 3-dimensional y seleccionar todos los canales de software de análisis. Haga clic derecho sobre el canal de cartílago y seleccione filtro de imagen y suavizado: Gauss (Figura 2B). </li><li> En vista de proyecto, haga clic derecho en la imagen filtrada y seleccione &#39;segmentación de la imagen &quot;y luego&quot; editar nueva etiqueta&#39;. Crear una nueva etiqueta para cada material, es decir, el cartílago y jmixto. Seleccione la región del cartílago de la imagen (Figura 2C, la señal de blanco, esquema púrpura) mediante la herramienta varita mágica. Utilice la herramienta de cepillo para eliminar el ruido de los contornos. NOTA: Si se utiliza la herramienta varita mágica, haga clic en &#39;Todos los cortes. </li><li> Seleccione la región de la unión con la herramienta de pincel y asignar a un componente de unión (Figura 2C, contorno azul) </li><li> Lisos múltiples cortes a la vez seleccionando la segmentación en el menú superior y etiquetas lisas. Haga clic derecho sobre la imagen y seleccionar generar superficie para producir una superficie 3D de procesamiento del componente (Figura 2D). </li><li> Haga clic en la superficie y guardar los datos como un archivo hmascii para su importación en el software de mallado. </li></ol> 3. Cálculo de las fuerzas de los músculos para ser utilizado en el modelo FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contar el número de fibras musculares de imágenes confocal de smyhc: GFP pez cebra transgénico (Figura 1A, punta de flecha, 1C) y medir el diámetroeter de las fibras para calcular su área de sección transversal (2 πr). </li><li> Identificar fuerza adecuada por unidad de área del músculo de la literatura. La fuerza muscular máxima generada por unidad de superficie de los músculos esqueléticos larvas de pez cebra (40 nN / 2 micras) se utilizaron 17. </li><li> Calcular las fuerzas para cada grupo muscular anatómica multiplicando el número de fibras y su área por la fuerza por unidad de área. Véase la Tabla 1. </li></ol> 4. Generación de una malla <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importe el modelo 3D generado en la sección 2 (arriba) en un paquete de software capaz de generar una malla de elementos finitos. </li><li> Generar malla A2D del cartílago y superficies de la articulación mediante el uso de la herramienta de plástico de embalar en el menú 2D. Elija un tamaño de elemento apropiado. Nota: Utilice un tamaño de elemento entre 1,5-2,5. Si es necesario, generar un rango de superficie 2D mallas de diferente tamaño para llevar a cabo la optimización de malla 3D (Sección 4.4). </li><li> Llevar a cabo controles de calidad de malla que se encuentran bajo el título «2D&gt; Herramientas&gt; Comprobar elementos&quot; del panel para comprobar si hay elementos duplicados, inserciones y penetraciones en la malla. Fijar los ángulos diedros mediante la ficha de utilidad en el árbol del modelo. </li><li> Generar una malla 3D a partir de las mallas de superficie 2D de diferente tamaño del elemento usando el subpanel 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Comparación de los resultados de diferentes tamaños de malla y seleccione el modelo FE con el tamaño de malla menor que converge después de nuevas simulaciones y no comprometa la definición de características. El ejemplo en la figura 3 contiene 1,5 millones de elementos tetraédricos de los cartílagos de la mandíbula inferior y tenía un tamaño de elemento 2D de 2,0. </li><li> Transformar la malla de modo modelo de mandíbula está a escala según pila confocal utilizando la geometría&gt; Distancia subpanel. NOTA: Asegúrese de que el cartílago y los componentes de la junta están conectados en el modelo mediante la exportación de un modelo resultante de la fusión o mediante el uso de lazos. </li></ol> 5. Elementos Finitos ModEL Construcción <ol><li> El uso de software comercial de elementos finitos (FE), crear un modelo de elementos finitos. Usando el músculo 3D y cartílago marcado pilas confocal generados en la sección 1 como una guía, asignar los nodos que corresponden a los puntos de unión de músculos. Crear un vector entre dos nodos que representan el origen y la inserción de cada músculo (Figura 3). </li><li> Crear un colector de carga de tipo &quot;historia&quot; de aplicar una &quot;carga C &#39;para cada músculo. Especificar la magnitud en Newtons (calculados en el paso 3.3) y asignar el vector asociado. La figura 3 muestra los puntos de unión para el aductor mandibular (AM), hioideo transportador (PH) y intermandibularis (IM). NOTA: Para estos músculos de la mandíbula, la máxima fuerza de contracción se distribuye entre el origen y la inserción de manera que se aplica sólo el 50% de cada carga en cada sitio. </li><li> Asignar propiedades del material isotrópico elásticas apropiadas como se determina por la literatura. El módulo de Young para el cartílagoy la interzona en este modelo fueron de 1,1 MPa y 0,25 MPa, respectivamente, y el coeficiente de Poisson fue de 0,25 para ambos 18,19. </li><li> Crear un colector de carga del tipo &#39;límite&#39; para aplicar limitaciones iniciales del modelo. Ir a la ficha Análisis&gt; Restricciones y en el subpanel crear, recoger los nodos en el modelo que desea restringir. Seleccione los grados de libertad (DOF) que limitan el movimiento del modelo a la mejor aproximación de su rango natural de movimiento. NOTA: El modelo de la figura 3 se vio limitada en todos los ejes de movimiento (DOF: 1, 2, 3 representan x, y, z, respectivamente) en el ceratohial para anclarlo en el espacio en un punto medio en el modelo y en el eje y y z en el punto donde la palatoquadrate conecta con el resto del cráneo pez cebra (Figura 3, Tabla 1). El modelo debe ser limitado en los tres DOF ​​en un un nodo menos. </li><li> Crear un &quot;paso Cargar &#39;, para cada tipo de movimiento que desea simulcomió (es decir, apertura, cierre), en el menú de análisis y seleccionar todas las cargas relevantes (hechas en la Sección 5.2) y restricciones (hecho en la Sección 5.4) para simular este movimiento. Seleccione &#39;estático&#39; desde el menú desplegable cuando aparezca. </li><li> modelo de exportación incluyendo la malla, cargas, restricciones y propiedades de los materiales en un formato de archivo apropiado, en este caso el formato &quot;.inp&quot;. </li><li> modelo de carga en el software de análisis de FE. Crear y ejecutar un trabajo para el modelo usando el módulo de empleo. </li><li> Analizar la salida de tensión, deformación, desplazamiento, etc. que se encuentra en la pestaña de resultados y el menú de visualización (Figura 4 y 5). </li></ol> 6. Validación de la mandíbula Deformación / Desplazamiento Distancias <ol><li> Seleccione 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) pez cebra transgénico. </li><li> Ligeramente anestesiar a las larvas con 0,02% MS222 hasta que dejan de responder al tacto, pero sus corazones siguen latiendo. </li><li> Montarlas larvas lateralmente (mientras anestesiado) en cubreobjetos en tibia de agarosa LMP al 1% (preparada en solución de Danieau). </li><li> Retire la agarosa a partir alrededor de la cabeza y la mandíbula con una pinza. </li><li> Enjuague solución fresca de Danieau (sin MS222) sobre la cabeza de la larva para eliminar la anestesia utilizando una pipeta Pasteur hasta que los movimientos normales de la boca se reanudan. </li><li> Utilice el software de captura de películas para tomar de campo brillante vídeos de alta velocidad de movimientos de la boca. Tome películas de alrededor de un minuto de duración en la velocidad de fotogramas más alta, o suficiente para grabar múltiples ciclos de apertura de la mandíbula. </li><li> Seleccione los fotogramas que muestran la mandíbula abierta a su máximo desplazamiento. Medir la distancia entre la punta anterior del cartílago de Meckel y el maxilar superior (punta de la placa etmoidal) en micras. </li><li> Calcular el desplazamiento medio de las larvas de peces múltiple. </li><li> Extraer datos de desplazamiento a partir del modelo. Utilice el desplazamiento promedio calculado en 6.8 para verificar el comportamiento de desplazamiento modelo ( <strong&gt; Figura 4). Si el modelo se desvía de lo esperado, el análisis de sensibilidad mediante la alteración de ejecutar secuencialmente las propiedades del material y cargas musculares. </li></ol>

<ol>
	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Algunos datos de las Figuras 3-5 se ha reproducido de J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Modelización de elementos finitos predice cambios de forma conjunta y comportamiento de las células debido a la pérdida de la tensión muscular en el desarrollo de la mandíbula, 3112-22. de 2015, con permiso de Elsevier 15.

Modelos de elementos finitos se han utilizado para relacionar las zonas de elementos esqueléticos que están bajo tensión con las que experimenta la formación de hueso 10, así como para mapear las áreas bajo tensión durante la osificación endocondral y la morfogénesis conjunta 8,12,21. Otros estudios también han sido capaces de aplicar los modelos teóricos de crecimiento para replicar los cambios durante el desarrollo conjunto 11,12. Aquí se muestra el protocolo para la construcción de modelos de FE para un sistema relativamente simple, la mandíbula de pez cebra 20. A diferencia de otros métodos de recopilación de imágenes en bruto para los modelos FE, tales como la TC 22, la imagen confocal de líneas transgénicas de pez cebra o inmunotinción permite múltiples tejidos para ser estudiados. Puede, por lo tanto, proporcionar información directa sobre los puntos de unión de músculos en relación con el cartílago. Entre los modelos de vertebrados pez cebra son particularmente susceptibles a la manipulación genética y farmacológica. La generación de modelos de FE para el pez cebracartílago craneofacial ahora se abre la posibilidad de un mayor estudio de la interacción entre la biomecánica y la genética en la morfogénesis conjunta. Hay una serie de pasos críticos para el proceso de creación de un modelo de elementos finitos; la primera es la generación de una representación tridimensional precisa del sistema. Esto requiere formación de imágenes a una resolución lo suficientemente alta como para definir claramente los límites. Tenga en cuenta que incluso con imágenes de alta resolución para hacer una buena superficie uno puede tener que suavizar algunas regiones. Otro paso crítico es la definición de la colocación correcta de la carga y las limitaciones correctos. Un modelo insuficientemente limitada fallará para resolver y la colocación incorrecta de las cargas provocará un movimiento anormal. Algunos de procesamiento de los datos en bruto (Figura 2) es necesario como una superficie generada a partir de los datos en bruto sería difícil de malla (Figura 2B). Filtramos los datos usando un filtro de Gauss (Figura 2C </strong&gt;) y que llevan a cabo algunos de suavizado manual de las curvas para producir un conjunto de contornos limpios que se pueden transformar en una superficie 3D. El exceso de suavizado puede producir una superficie &quot;fundido&quot; que ha perdido muchas de sus características. Elegir el tamaño del elemento correcta es un proceso iterativo como elegir demasiado pequeño un tamaño de elemento demasiado grande crea una malla que es computacionalmente intensivas. Sin embargo, elegir demasiado grande un tamaño de elemento producirá una malla que no recapitular la forma correcta de la estructura. La malla correcta tenía el tamaño más pequeño elemento que capturó la forma correcta de la mandíbula y se reunieron en una solución correcta, verifica por medio del desplazamiento de la mandíbula. También puede ser necesario modificar las propiedades del material o de los cálculos de carga para emular mejor el desplazamiento correcto como diferentes edades y especies tendrán propiedades sustancialmente diferentes. Es importante recordar que siempre hay limitaciones a un modelo hipotético y unassumptions hizo correr modelos FE. Cuando sólo el modelado de uno o un pequeño número de muestras es crítica para asegurar que una muestra representativa se elige ya que es probable que sean pequeñas variaciones entre los individuos. Ya que sólo se incluyeron algunos de los elementos de mandíbula y los músculos, el modelo es una versión simplificada del sistema músculo-esquelético craneofacial pez cebra. Por lo tanto, las restricciones tuvieron que ser posicionado para tener en cuenta cuando los elementos de mordaza modelados conectarían con el resto del cráneo y el modelo fueron limitadas artificialmente en el centro para fijarlo en el &quot;espacio&quot;. Esta restricción artificial no tuvo ningún impacto sobre la interpretación extraída de los modelos como el ceratohial en sí no fue analizado. La inclusión de más de la estructura craneofacial, especialmente otros músculos de la mandíbula de apertura como los sternohyals y su cartílago adjunta 23, podría haber añadido al modelo, pero las limitaciones incluyen la capacidad de los modelos más grandes para funcionar en el software de elementos finitos. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Otra limitación es que no hemos modelado inserción de ligamentos, aunque esto podría lograrse mediante la inserción de los resortes 8. Otra suposición hecha en este caso fue que el modelo se comportaría de forma lineal. Las magnitudes de las tensiones en los modelos eran comparables a los de los modelos publicados y se aplicaron a células in vitro 10,24, con cepas de estar por debajo de 3500 y por encima de -5,000 μɛ aparte de puntos de restricción y de unión de músculos. Por lo tanto, las cepas en las regiones relevantes del modelo se consideraron dentro de un rango aceptable para un modelo lineal. El cartílago no se comporta como un material enteramente lineal y previamente se ha modelado como un material poroelástico, lo que permitió el análisis del comportamiento del fluido en el modelo de 25. La difusión de los puntos de unión de músculos entre un grupo de nodos locales distribuiría los picos de fuerza y ​​representar con mayor precisión la inserción del músculo de ciertos músculos. ent &quot;&gt; El uso de FE permite una evaluación de las deformaciones y tensiones que actúan sobre una estructura. Como una técnica que se utiliza con frecuencia en muchas disciplinas de ciencias biológicas, incluyendo la ortopedia, la paleontología y más recientemente la biología del desarrollo. A continuación se describe cómo construir FE para el pez cebra la mandíbula inferior. en el futuro estos modelos podría extenderse a mirar a toda la mandíbula, que incluye el paladar. técnicas similares se podrían utilizar para modelar la biomecánica de la columna vertebral en el pescado, que hasta la fecha la mayoría han sido estudiados por medios cinemáticos.

Modelización de elementos finitos (FE) es una técnica de ingeniería que computacionalmente puede calcular y asignar la magnitud y la localización de las cepas que actúan sobre una estructura 1. El modelo consta de la estructura 3D, representada por una malla de &quot;elementos finitos&quot;, y el resultado final del análisis se rige por una serie de factores incluyendo la estructura y número de elementos de la malla, la magnitud y la ubicación de la mecánica cargas y las propiedades del material. Propiedades de los materiales describen ciertos aspectos del comportamiento de un material bajo un determinado tipo de carga; el módulo de Young (E) describe la elasticidad del material, mientras que la relación de Poisson describe la disminución proporcional en la anchura de un material a su longitud cuando se estira una muestra. modelado FE se puede utilizar para calcular una variedad de variables tales como el desplazamiento, el estrés, la presión y la tensión que actúa sobre el modelo teniendo en cuenta los datos de entrada único acerca de la estructura &#39;; S forma, ubicación y magnitud de las cargas y de las propiedades de los materiales específicos. Modelado de FE es ampliamente utilizado en la ingeniería 2 y 3 cada vez más para ortopédicos y paleontológicos aplicaciones 4. En el desarrollo se conocen fuerzas biomecánicas para actuar como un estímulo en muchas células para activar respuestas de las células 5-8 y es útil para predecir tanto las posiciones relativas y las magnitudes de los estímulos mecánicos dentro de desarrollo de sistemas de órganos, sin embargo, en la actualidad modelado FE ha sido poco utilizado para el desarrollo de pez cebra. Tanto el cartílago y el hueso se ha demostrado que ser materiales mechanosensitive. Por ejemplo, la compresión in vitro se ha encontrado para activar las vías condrogénicas, mientras que la tensión se ha demostrado que es necesario para la formación de hueso 9. análisis FE (FEA) se ha explotado para modelar cepas que actúa en muestras biológicas, incluyendo las que actúan sobre los elementos esqueléticos durante hueso formación 10. Otras aplicaciones de desarrollo incluyen su uso para predecir la forma de una articulación después de que ha sido expuesto a fuerzas biomecánicas teóricos 11,12 y para mostrar el patrón de las cepas presentes durante polluelo rodilla morfogénesis conjunta 8. Este protocolo está dirigido a compartir la experiencia de la generación de superficies de 3 dimensiones, mallas y modelos de elementos finitos de imágenes confocales con miras a la comprensión de la mecánica de los tejidos en desarrollo. También ponen de manifiesto formas de validar los modelos FE pesar de la captura de información conjunta desplazamiento real en vivo. Mientras que utilizamos la mandíbula de pez cebra como un ejemplo de las mismas técnicas podrían utilizarse en cualquier sistema biológico pequeño para el que la información en 3D sobre la estructura del sistema musculoesquelético se puede obtener mediante formación de imágenes confocal o multifotónica.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>For mounting zebrafish</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>To make anesthetic</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>sample permeablilisation</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE confocal</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D image analysis software (Section 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE model generating software (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

La inmunotinción para muscular (Figura 1A) y el cartílago (Figura 1B) o formación de imágenes de reporteros transgénicos (Figura 1C) permite que la estructura 3D de la mandíbula para ser visualizada, junto con la musculatura asociada. Por formación de imágenes a alta resolución que era posible construir un modelo que captura tanto la forma tridimensional de la mandíbula (Figura 2) y la ubicación y la colocación de las cargas (Figura 3). La utilización de los desplazamientos in vivo visto a través de la captura de vídeo de alta velocidad (Figura 4) se verificó que el rango de movimiento en el modelo estaba dentro de un rango realista. Los modelos FE Una vez ejecutado se pueden utilizar para mostrar una variedad de datos, como el estrés (Figura 5A), mínimo y máximo de deformaciones principales (Figura 5B - K). Estos resultados son de tres dim<html> ensional lo que el modelo se puede ampliar para ver patrones finos de detalle (Figura 5E, 5I) hace girar para obtener puntos de vista relevantes (Figura 5F, 5G, 5J, 5K) y digital seccionadas (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) para mostrar cómo los patrones de tensión, deformación o cambio de presión en todo el modelo. También es posible extraer los datos cuantitativos a partir del modelo (no mostrado). Al verificar el modelo y el uso de las propiedades de los materiales más precisos, cargas y malla forma el modelo FE puede ser utilizado para explorar la mejor estimación del entorno mecánico experimentado por las células durante esa ventana de desarrollo. Los resultados del modelo se pueden comparar directamente con los cambios en el comportamiento celular y la expresión génica 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Imágenes representativas de los elementos del aparato locomotor de la mandíbula inferior del pez cebra a 5 dpf pilas confocal representativos de la mandíbula inferior de las larvas 5dpf muestra con toda anterior al inicio (A) La inmunotinción para A4.1025 que tiñe toda la miosina esquelética (B) la inmunotinción para el colágeno tipo II que marca todo el cartílago (C) Pila de una larva viva expresión de los reporteros COL2A1 transgénicos: mCherry marcado cartílago (rojo) y smyhc: GFP músculo lento (verde). IA: intermandibularis anterior, PH: transportador hioideo, AM: mandibular aductor, Hawai: hioideo inferior, Hawai: hioideo superior, CH: esternohioideo, MC: cartílago de Meckel, PQ: palatoquadrate, CH:. Ceratohial <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: Generación de una superficie 3D a partir de datos confocal de imágenes que muestran la transición de datos confocal en una superficie 3D de la mandíbula inferior del pez cebra con una mayor ampliación de la zona de unión.. (A) los datos sin procesar confocal; (B) del conjunto de datos después de la aplicación de un filtro de Gauss; (C) Esquema filtrada; Superficie (D) en 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: mallas representativo que muestra las limitaciones y los vectores de fuerza mallas representativos para una larva 5 dpf para (A) de cierre y la boca.(B) abertura de la boca. Los puntos blancos indican los lugares donde se ve limitada el modelo y en el que las dimensiones (por ejemplo, x e y o x, y y z). Las líneas blancas indican las posiciones de músculos, con el vector de la fuerza muscular indicado por las flechas blancas. Rojo muestra el cartílago y la interzona amarillo. Esta cifra ha sido modificado a partir de material complementario publicado previamente en Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Pruebas de sensibilidad FE-modelo que simula el desplazamiento de la mandíbula en el pez cebra 5dpf para diferentes cartílago y interzonales módulos de Young. La mandíbula de desplazamiento (abierto a cerrado en micras) está marcado en la mandíbula; grabada utilizando la tecla de color. Cada modelo (A - L) tiene una combinación diferente de cartílago (c = 1,1, 3,1, o 6,1 MPa) o 1 MPa propiedades) interzona (i = de 0,25, 0,5, 0,75, o. Horizontal flecha negro resalta el valor del desplazamiento de la mandíbula en la punta del cartílago de Meckel (representado por la flecha negro vertical). M y N fotogramas de vídeos de 5 dpf larvas que presenten mínimo, es decir, la mandíbula cerrada (M) y el máximo, es decir, la mandíbula completamente abierta (N) con los dos superpuesta (O) - línea blanca en O representa el desplazamiento (de 43 micras). En este caso las propiedades del cartílago relativa de 1,1 con una interzona de 0,25 (A) la mejor partido de los desplazamientos observados en peces vivos (O). Sobre placas de aluminio de esta figura se han publicado previamente en Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para conocer el vers más grandes</a>ión de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: Los datos representativos de los modelos de simulación FE FE-modelo de todos los músculos aplicados en un 5 dpf larva (A - C).. (A) de Von Mises (EMaxmin) (B) cepa principal mínimo (E Min. P, μɛ) (C) la tensión principal máxima (E máx. P., μɛ). simulación con EF-modelo de cepas máximos y mínimos principales durante la apertura de la mandíbula. (D - K): la tensión principal máxima (. E Max P., μɛ) en (D) Muestra de la mandíbula ventral y (E) vista conjunta ventral (E) muestra la ubicación de las secciones proximal-distal a través del cartílago de Meckel conjunta y la interzona en (e &#39;) y (e&#39; &#39;), respectivamente. (F): lateralla mandíbula vista. (G): vista lateral conjunta. (H - K): la tensión principal mínima (. E Min P, μɛ) en (H) vista ventral y la mandíbula (I) vista conjunta ventral. (I) muestra la ubicación de las secciones proximal-distal a través del cartílago articular de Meckel y en interzona (I &#39;) y (I&#39; &#39;) respectivamente (J): Vista lateral de la mandíbula. (K): vista lateral conjunta. Esta cifra ha sido publicado previamente en Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Número de fibras musculares </td><td> Área de la fibra muscular (m 2) </td><td> área de grupo muscular (micras2) </td><td> Fuerza (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anterior </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf transportador hioideo </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf aductor mandibular </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: La cuantificación del músculo. Calculado promedio fuerzas musculares para el Intermandibularis anterior, aductor mandibular y prolongador hioideo a 5 dpf utilizando 40 nN / m 2 (valor por unidad de superficie tomado de referencia 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Watch this Scientific Journal Video about Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics at JoVE.com

Construcción de modelos de elementos finitos para investigar la biomecánica de la mandíbula del pez cebra | Biología del desarrollo | Video

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

9.1K vistas.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

Video: Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Métodos para el Estudio de la barbo pez cebra maxilar

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Biología

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

<meta charset="utf8"></head><body>Extracción de escamas de pez cebra para el cultivo y los estudios de biología ósea

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Avance en la investigación de la actividad de las células óseas con escamas de pez cebra

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Métodos para el Estudio de la barbo pez cebra maxilar

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal