The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

Balb / c o topi NMRI (Mus musculus) dalla nostra colonia riproduttiva presso l&#39;Università di Potsdam (Potsdam, Germania) sono stati utilizzati per la produzione di anticorpi monoclonali. Il lavoro animale è stato condotto in base alle pertinenti linee guida nazionali ed internazionali. Lo studio è stato approvato dal Ministero del Brandeburgo Ambiente, salute e protezione dei consumatori (numero di riferimento V3-2347-A16-4-2012). 1. Preparazione di immunoconiugati <ol><li> Per accoppiare l&#39;antigene ad un vettore, utilizzare protocolli di attacco standard via amino-, carbossilici o sulfo-gruppi, come da glutaraldeide, N - (3-dimetilamminopropil) - N -ethylcarbodiimide (EDC), o N - [y-maleimidobutyryloxy ] succinimmide estere (solfo-GMBS). </li><li> Per meccanico (per esempio, con glutaraldeide) 13, utilizzare la proteina bersaglio o peptide e il vettore (ovoalbumina, sieroalbumina bovina, o keyhole limpet hemocyanin) in un rapporto 1: 1. Diluire il pr bersagliootein o peptide in tampone fosfato salino (PBS) e la proteina carrier in 50 mM NaHCO 3 buffer. Adattare il volume e la concentrazione per la quantità necessaria per le vaccinazioni. <ol><li> Mescolare entrambe le soluzioni e aggiungere 1,25% glutaraldeide. Mescolare e incubare il campione per 4 ore a temperatura ambiente (RT). Per selezionare le cellule di ibridoma, rendere lo stesso immunoconiugato, ma con un altro vettore, al fine di evitare la selezione di leganti carrier aspecifiche. </li></ol></li><li> Dializzare campione accoppiamento eseguendo una dialisi veloce con resina commerciale grossolana (ad esempio, Sephadex G25). <ol><li> Perforare il fondo di una fiala di reazione da 1,5 ml con un ago cavo e collocarlo in una provetta da 15 ml. Mettere lana di vetro nella parte inferiore per sigillare e coprire con 300 mg di resina grossolana (a volume di 0,5 mL). </li><li> Con attenzione, mettere 1 ml di PBS goccia a goccia in un tubo di reazione da 1,5 ml e fare in modo che la lana di vetro è ancora sigillando la perforazione. Lasciate che la resina grossolana sbene e centrifugare la colonna a 500 xg per 2 min. Una tale colonna può essere utilizzata per dializzare 200 microlitri del campione accoppiamento. Per i volumi più elevati, rendere più colonne. </li><li> Cambiare il tubo e rilasciare la soluzione di accoppiamento sulla resina grossolana gonfiato. Centrifugare nuovamente a 500 xg per 2 min. Rimuovere l&#39;eluente dal tubo e utilizzarlo per l&#39;immunizzazione. </li></ol></li></ol> 2. immunizzazione degli animali <ol><li> Scegli due o tre da 6 a 12 settimane di età topi Balb / c per l&#39;immunizzazione. </li><li> Per un animale, preparare 150 - 200 ug del immunoconiugato in 200 ml di PBS e mescolare con 100 ml di adiuvante completo Freund&#39;s (CFA). Mescolare la soluzione 3 volte con un ago corto e sottile (0,6 mm di diametro) in una siringa da 1 ml. Iniettare la soluzione per via intraperitoneale nel mouse. </li><li> Dare un iniezione di richiamo 6 settimane più tardi con la stessa quantità del immunoconiugato, ma senza CFA. Prendere il sangue 7 giorni dopo (fuori del seno retroorbital) e prepare il siero incubando il sangue per 3 - 4 ore a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Centrifugare la miscela a 3.000 xg per 5 min. Prendere il surnatante siero e trasferirlo in un nuovo tubo. Conservarlo a -20 ° C. Eliminare il pellet. </li></ol></li><li> Analizzare i sieri tramite ELISA, come descritto al punto 3. Per la fusione, scegliere il mouse con il più alto titolo di siero. </li><li> In preparazione per la fusione delle cellule, aumentare il mouse con 150 - 200 ug del immunoconiugato in 300 ml di PBS senza adiuvante solo 4 giorni prima della fusione. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> Preparare una soluzione di antigene con una concentrazione di 5 mg / ml in PBS e trasferire 50 microlitri in ciascun ELISA pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C o per una notte a 4 ° C in una camera umida. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con acqua di rubinetto. Bloccare i pozzetti con 80 ml di PBS / 5% di siero di vitello neonatale (NCS) per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente in un ch umidoambra. Preparare le diluizioni di siero in un 1: Serie 5 a partire da 01:50. Per l&#39;analisi della coltura cellulare, usare la cultura surnatante non diluito. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con acqua di rubinetto. Pipettare 50 ml del campione per pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umida. Preparare la soluzione di anticorpo secondario in una diluizione 1: 5000 di un anticorpo IgG anti-topo di capra coniugato con perossidasi di rafano (HRP). </li><li> Lavare la piastra 3 volte con acqua di rubinetto e aggiungere 50 ml della soluzione di anticorpo secondario per pozzetto. Incubare per 45 minuti a RT in una camera umida. </li><li> Preparare una soluzione substrato fresco. Fare soluzioni stock di 0,1 M NaH 2 PO 4 perossido di idrogeno e lo 0,1%. Prendere 5 parti NaH 2 PO 4, 4 parti di perossido di idrogeno, e 1 parte di tetrametilbenzidina per la soluzione substrato fresco. <ol><li> Lavare la piastra 10 volte con acqua di rubinetto. Pipettare 50 ml di soluzione di substrato fresco nei pozzetti e incubare per 5 - 10 minuti inbuio. </li></ol></li><li> Arrestare la reazione con 50 microlitri 1 MH 2 SO 4 per pozzetto. Utilizzando un lettore di piastre, misurare la densità ottica a 450 nm con una lunghezza d&#39;onda di riferimento a 630 nm. </li></ol> 4. Preparazione del mieloma culture cellulari <ol><li> D&#39;ora in poi, eseguire tutti i lavori in condizioni sterili. </li><li> Preparare il mezzo di coltura fresco per la coltivazione delle cellule. Supplement 500 ml di RPMI1640 con 10% siero fetale di vitello (50 mL), 2 mM L-glutammina (5 mL), e 50 mM mercaptoetanolo (5 mL). Sostituire la glutammina ogni 7 giorni. </li><li> Scongelare una fiala di murine SP2 / 0 cellule in acqua tiepida. Trasferire la soluzione di cellule in 10 ml di terreno di coltura fresco e centrifugare per 10 min a 200 x g. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di coltura fresco. </li><li> Trasferire le cellule in 2 beuta da 25 cm e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore. Espandere le cellule a due 75-m 2 palloni BEFla fusione del minerale. Conservare aliquote per la conservazione a lungo termine, come descritto al punto 7. </li></ol> 5. Preparazione di cellule di alimentazione <ol><li> Sacrifica una 12 settimane di età del mouse NMRI (secondo le linee guida nazionali ed istituzionali, ad esempio, da CO 2 inalazione). Rimuovere la pelliccia e pulire l&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Iniettare 5 ml di ghiaccio freddo media RPMI nell&#39;addome, massaggiare l&#39;addome con una pinzetta, e aspirare la sospensione cellulare alimentatore. Collocare le cellule in un tubo vuoto a 50 mL. Eseguire questo passaggio ancora una volta. 7 a 10 ml di sospensione cellulare alimentatore devono essere recuperati. </li><li> Preparare una sospensione cellulare alimentatore da 100 mL aggiungendo 90 ml di terreno di coltura cellulare completo (RPMI 1640, 10% di siero fetale di vitello, 2 mM glutammina e 50 mM mercaptoetanolo). Mescolare e trasferire 100 l / pozzetto in piastre di coltura cellulare 10 x 96 pozzetti. Incubare le piastre per una notte a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore. </li></ol> 6. fusione cellulare<ol><li> Sacrificare il immunizzato da dislocazione cervicale o di CO 2 inalazione e accise la milza 14. Prendere sangue addizionale dal cuore e preparare il siero, come descritto nel passaggio 2.3, come controllo positivo in ELISA. </li><li> Preparare una sospensione di cellule spleniche premendo milza attraverso un colino cella. Riempire fino a 20 ml con mezzo di coltura cellulare completo. Raccogliere le cellule in provette da 50 ml per centrifugazione (200 xg, 10 min, 4 ° C). Eliminare il surnatante. </li><li> Risciacquare il pallone di coltura delle cellule e raccogliere le cellule del mieloma per centrifugazione (200 xg, 10 min, e il 4 ° C) e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 20 mL di tampone salina bilanciata (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl 2, 2.5 mM MgCl 2, e 5 mM Tris-HCl, pH 7.4) e centrifugare di nuovo. Ripetere il lavaggio passi tre volte. </li><li> Per la regolazione del splenocyte: rapporto di cellule di mieloma, contare le cellule dopo la seconda fase di lavaggio da abetest risospendere il pellet in 1 ml di tampone BSS. Effettuare una diluizione 1:10 e trasferire 10 microlitri di una camera di conteggio delle cellule. Contare le cellule e determinare la concentrazione cellulare in 1 mL. </li><li> Regolare il numero di cellule nel buffer BSS a tre-parti di splenociti e le cellule di mieloma di un pezzo in un volume finale di 1 ml. Prendere 200 microlitri della sospensione cellulare e mescolare con 200 ml di PEG8000 (1 g in 4 mL di tampone BSS). Trasferire 400 microlitri in una cuvetta elettroporazione con un diametro di 2 mm e impostare l&#39;impulso (600 - 650 V e 25 ms). <ol><li> Dopo l&#39;impulso, incubare le cellule a temperatura ambiente per 3 minuti nella cuvetta. Rimuovere le cellule e metterli goccia a goccia in una beuta con 100 mL di HAT Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutammina, 50 mM mercaptoetanolo, 100 pM ipoxantina, 5.8 pM azaserine, e 16 mM di timidina). </li><li> Ripetere la fusione 4 volte fino a quando è trascorso il lotto 1-mL. Incubare la beuta per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2in un incubatore. </li></ol></li><li> Supplemento la sospensione cellulare di nuovo con ipoxantina, azaserine, e timidina prima placcatura le cellule sullo strato alimentatore. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare per pozzetto alle piastre feeder layer e incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2 (in un incubatore). La concentrazione finale all&#39;interno del pozzo deve essere di 100 micron ipoxantina, 5.8 micron azaserine, e 16 micron timidina. </li><li> Eseguire un&#39;analisi microscopica (ingrandimento: lente obiettivo 10X, 10X oculare) per la crescita clonale in ciascun pozzetto della piastra dopo 7 giorni, al fine di determinare se i pozzi sono mono o policlonali. cellule monoclonali sono un cluster di cellule originate da una singola cellula. cellule policlonali sono diversi gruppi di cellule in un pozzo. Cambiare il supporto completo dopo 7 giorni e incubare ancora per 7 giorni in mezzo HAT. </li><li> Modificare il mezzo HAT e coltivare le cellule in terreno di coltura cellulare pieno. Utilizzare il surnatante per eseguire una ELISA, come descritto nel passaggio 3. cellule di ibridoma positive deve essere espanso in piastre da 24 pozzetti secondo i test per la produzione di anticorpi specifici. Se le cellule sono policlonali, una diluizione limitata deve essere effettuata (descritto al punto 8). </li></ol> 7. crioconservazione di ibridomi <ol><li> Cryoconserve mono positivo e ibridomi policlonali per la conservazione a lungo termine. Raccogliere le cellule da una piastra 24 pozzetti con una confluenza di&gt; 60% per centrifugazione (200 xg, 10 min, 4 ° C). </li><li> Risospendere il pellet in 500 ml di piena terreni di coltura cellulare e trasferirlo in un cryotube. Aggiungere 500 ml di mezzo di congelamento (RPMI 1640, il 20% FCS, e il 15% dimetilsolfossido), mescolare, e metterlo in in una scatola di polistirolo o di una scatola di congelamento speciale. Conservare a -80 ° C per 3 giorni. Dopo 3 giorni, il cryotube può essere trasferita in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 8. diluizione limite di policlonale ibridomi <ol><li> makEA cultura feeder layer, come descritto al punto 5. Harvest cellule policlonali positive, come descritto al punto 7.1. Contare le cellule, come descritto al punto 6.5, e regolare il numero di cellulare a 10 cellule / ml, con un volume finale di 10 ml per una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri / pozzetto sullo strato alimentatore. </li><li> Incubare per 7 giorni a 37 ° C e analizzare la crescita clonale microscopio (ingrandimento: 10X lente dell&#39;obiettivo, 10X oculare). Fare un test ELISA del surnatante cultura, come descritto al punto 3, ed identificare le ibridomi monoclonali appropriati per la cultura di massa. </li></ol> 9. Massa cultura e Purificazione di anticorpi monoclonali <ol><li> Trasferire i ibridomi monoclonali con gli appropriati segnali ELISA a 25 cm 2 o 75 cm 2 palloni e raccogliere fino a 500 ml di surnatante cultura. Testare il settimanale di coltura per la produzione di anticorpi specifici e conservare 3 - 5 aliquote per ibridoma per la conservazione a lungo termine, come descritto al punto 7. </li><li&gt; Centrifugare il supernatante della coltura a 4.900 xg e 4 ° C per 15 minuti e filtrata attraverso un filtro da 0,45 micron. Mescolare il surnatante con tampone (4 M NaCl e 2 M glicina NaOH, pH 8.9) vincolante in un rapporto 3: 1. </li><li> Preparare una proteina Una colonna mediante lavaggio con tampone di lavaggio (diluire il tampone di legame 1: 3 in dH 2 O). Passare il surnatante dal punto 9.2 sopra la colonna e raccogliere il flow-through. Eluire l&#39;anticorpo legato con 0,1 M citrato, pH 3,5 e neutralizzare immediatamente il pH con 500 ml di Tris-HCl, pH 9,0. </li><li> Caratterizzare l&#39;anticorpo eluita mediante SDS-PAGE, Western Blot, ed ELISA, e convalidare per l&#39;applicazione finale. <ol><li> Per la pagina SDS, prendere 3-5 mg di soluzione di anticorpo purificato per corsia (un campione di 20 ml), aggiungere 5 ml di 4x SDS tampone campione di carico (8% SDS, 20% 2-mercaptoetanolo, 40% glicerina, e 0.015 % bromofenolo, ridotto), e riscaldare le sonde a 95 ° C per 5 min. Come controllo, utilizzare lo stesso campione con un purificatontibody dello stesso isotopo, ma la specificità irrilevante. </li><li> Caricare i campioni su un gel SDS 12,5%, posizionare 5 ml di una scala di proteine ​​senza macchia in una corsia supplementare, e separarli mediante elettroforesi. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue e documentare i risultati. Un protocollo di base SDS è stato istituito con Laemmli nel 1970 15. </li></ol></li></ol>

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The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

La generazione di anticorpi monoclonali di IBRIDOMA richiede un&#39;analisi intensa e dettagliata epitopo, soprattutto per quanto riguarda l&#39;applicazione finale, quando l&#39;anticorpo dovrebbe riconoscere il bersaglio. Questo è spesso sottovalutata dagli utenti e conduce agli anticorpi con prestazioni deboli. Il processo di fusione è sempre casuale, il che significa che il risultato di ibridomi specifici è fortemente dipendente dal rapporto cellulare e la vitalità a questo punto. Dopo diluizione limitata, le ce...

Il IBRIDOMA presentato in questo protocollo è stato descritto da Köhler e Milstein 1 nel 1975 e, ad eccezione di alcuni miglioramenti tecnici, la procedura principale non è cambiata radicalmente nel corso degli ultimi 40 anni 2. Lo scopo di questo protocollo è quello di spiegare una strategia più appropriata di immunizzazione, un metodo standard per la generazione di anticorpi monoclonali, e un esempio di un metodo di convalida (ELISA). Gli anticorpi sono strumenti incredibili e contribuiscono ad una vasta gamma di approcci tecnologici, come la citometria a flusso, l&#39;ordinamento delle cellule magnetiche, o immunofluorescenza, nonché alle opzioni diagnostiche e terapeutiche per il monitoraggio e il trattamento della malattia 3. La disponibilità commerciale di anticorpi monoclonali per il target desiderato è dimostrata dalla presenza di oltre 24 diversi database web con quasi innumerevoli quantità di anticorpi o prodotti anticorpi legati 4. Nel 2015, unmolecole ntibody facevano parte di un dibattito internazionale 5-7 a causa di seri problemi in una corretta validazione e caratterizzazione di anticorpi disponibili in commercio. Può essere difficile e costoso trovare anticorpi specifici per un antigene bersaglio, e spesso, non hanno affinità o la specificità necessaria. Sebbene generando un anticorpo è ancora tempo e richiede personale specializzato per sviluppare e convalidare l&#39;anticorpo, producendo un anticorpo singolarmente potrebbe meglio di acquistare uno. A causa del fatto che la produzione di anticorpi richiede tempo e richiede esperienza, metodi alternativi per la produzione di molecole di legame sono state sviluppate per superare questi problemi. Il metodo alternativo più comunemente usato è la produzione ricombinante di anticorpi a catena singola con phage display. I geni per la regione di legame variabile vengono estratti dalle cellule e combinati con la proteina di rivestimento di un fago. i scatena ingle viene espresso sulla superficie di un batteriofago e proiettato in diversi passaggi panning 8. La produzione di anticorpi a catena singola è un po &#39;più veloce, ma richiede anche un abile sperimentatore. Gli svantaggi di alcuni anticorpi a catena singola ricombinanti sono scarsa stabilità e la mancanza di idoneità della diagnostica in vitro. Nella maggior parte dei test diagnostici, un Fc-recettore per il rilevamento è necessario, che deve essere aggiunto ad un anticorpo a catena singola ricombinante dopo. Di nuovo, questo richiede tempo e ancora più complessa rispetto alla tecnica ibridoma. Nella diagnostica in vitro, full-length monoclonale di topo e di coniglio anticorpi sono stati dimostrato di essere la scelta migliore. Uno dei principali passi nella generazione di anticorpi monoclonali deve essere fatto prima che il lavoro in laboratorio inizia: il disegno del immunoconiugato. Le domande che devono essere affrontate sono: Qual è la composizione fisica del bersaglio nella Applicat finaleione, e le cui matrici sono presenti? Quale concentrazione target avere nella domanda? Qual è l&#39;applicazione finale, e quali sono i requisiti che l&#39;anticorpo deve soddisfare? Sempre tener conto che se viene usato un frammento peptidico lineare, deve anche essere lineare nel epitopo finale nella destinazione di scelta; altrimenti, l&#39;anticorpo non si legherà. Naturalmente, indipendentemente dal metodo di screening, anticorpi potrebbero essere selezionati per riconoscere diversi formati antigenici in diverse applicazioni, ma devono essere convalidati molto preciso. Queste sono le ragioni per le quali lo sviluppo di anticorpi e la convalida sono tali processi ambiziosi. La scelta del formato antigenica per l&#39;immunizzazione è fondamentale per lo sviluppo di anticorpi e determina il successo o il fallimento di questo processo. Una volta che i topi esprimono un rilevante titolo anticorpale, le cellule di milza sono isolati e fusi con cellule di mieloma. Le linee cellulari di mieloma più comunimurino lo sviluppo di anticorpi monoclonali sono X63-Ag 8,653 9 e Sp2 / 0-Ag 14 10 da una / c ceppo di topi Balb. Le cellule discendono da un linfoma a cellule B maligni e sono stati selezionati perché non secernono qualsiasi delle loro catene pesanti e leggere. Le cellule possono essere adattati ad un rapporto compreso tra 1:10 e 10: 1 (splenociti contro cellule di mieloma). In questo protocollo, le cellule sono state adattate ad un rapporto di 3: 1 e fuse da polietilenglicole (PEG) e elettrofusione, secondo Stoicheva e Hui 11. La fusione di cellule B e cellule di mieloma è un processo casuale. Pertanto, ibridi di due B linfociti o due cellule di mieloma potrebbero essere generati, ma questi ibridi non sarebbero in grado di sopravvivere per un lungo tempo di coltura. Le cellule subiscono una selezione ipoxantina, aminopterina e timidina (HAT), per cui solo le cellule di ibridoma fuse possono sopravvivere grazie alla possibilità di utilizzare il percorso de novo di sintesi delle pirimidine. Per la generazione di monanticorpi oclonal, è necessario ottenere una linea cellulare proveniente da una cellula madre. Il monoclonalità è garantita limitando le tecniche di diluizione e l&#39;analisi microscopica della crescita cellulare. I sovranatanti di ibridoma sono proiettati per la produzione di anticorpi specifici, per lo più da ELISA o citometria a flusso, e le migliori leganti sono selezionati. Dopo cultura di massa e la purificazione, la molecola anticorpo può infine essere caratterizzata e convalidato per l&#39;applicazione desiderata.

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

La Figura 1 mostra un esempio del titolo sierico antigene-specifica per una vaccinazione effettuata in laboratorio. In questa figura, i sieri immuni A e B sono stati titolati da 1:50 a 1: 5.000.000 rispetto a un siero di un mouse naif. L&#39;antigene è stato rivestito sulla fase solida e gli anticorpi specifici sono stati rilevati con una capra POD-coniugato anticorpo anti-topo Ig. Entrambi i sieri dei topi immunizzati mostrato una significativamente maggiore titolo ant...

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Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.5K Views.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Generazione di anticorpi: produzione di anticorpi monoclonali attraverso l'utilizzo di ibridomi

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia avanzata

Immunologia

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

Generazione di anticorpi monoclonali ricombinanti da colture cellulari di mammifero

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

Una tecnologia di ibridomi per la produzione di anticorpi monoclonali contro una metallopeptidasi

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

Una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

Tecnologia degli ibridomi

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...