Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Site Yeri <ol><li> Böyle bir çiftlikte gibi uygun bir siteden silaj örneği toplayın. Burada, çiftlik Ballydulea, Co Cork, İrlanda (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W) yer oldu. </li></ol> 2. DNA Ekstraksiyon Not: DNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Resim örnek bulunan bir negatif kontrol, kütüphane Hazırlama yöntemi içinde kullanıldı. <ol><li> Verilen parçalama tüplerinde 978 uL sodyum fosfat tamponu ve 122 ul toprak lizis tamponu numune 400 mg - 100 ekleyin. </li><li> 6.0 m / s kadar bir hızda 40 saniye boyunca homojenleştirici lizis tüpleri yerleştirerek örnekleri homojenize. </li><li> Santrifüj lizatları 15 dakika 14.000 xg&#39;de ve Protein Çökelti Çözüm 250 ml (PPS) içeren temiz bir mikro-santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. 10 kez ve santrifüj tersini çözüm karıştırın5 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de. </li><li> Temiz bir 15 mL santrifüj tüpünde 1 ml DNA bağlama matrise süpernatant ekleyin. 3 dakika boyunca sürekli tersini tüp çözüm karıştırın. Karışım, daha sonra, 3 dakika razı yüzer 500 uL atmak için izin verir. kalan süpernatant karıştırın. </li><li> 1 dakika için 14,000 x g&#39;de bir eğirme filtresi ve santrifüj süspansiyon 600 ul aktarın. süzüntü atın ve kalan süspansiyon işlemi tekrarlayın. </li><li> daha sonra 1 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüj, pipetleme karışım, sıkma filtre içinde DNA bağlama matrisi yıkama tamponu 500 ul ekle. </li><li> süzüntü atın ve 2 dakika tüm yıkama tamponu kaldırılır sağlamak için 14.000 xg tekrar sıkma filtresi santrifüj. 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de santrifüj kurutun. </li><li> Pre-sıcak (70 ˚C) DNaz içermeyen su (DES) ve yeniden askıya sıkma filtre içinde DES 100 uL DNA bağlayıcı matris. Temiz bir 1.5 ml mikro santrifüj tu spin filtre aktarınolacak ve 1 dakika DNA Zehir için 14.000 xg&#39;de santrifüj. daha fazla analiz yapılana kadar -20 ° C&#39;de arıtılmış, DNA saklayın. </li></ol> 3. DNA Saflaştırma kullanılarak DNA saflaştırma Boncuk Not: Alınan DNA saf DNA örneği sağlamak için saflaştırma boncuklar kullanılarak saflaştırılmıştır Önceki metagenomic kütüphanesi hazırlanmasında elde edildi. <ol><li> kullanımdan önce, 30 dakika boyunca 23 ° C&#39;de boncuk inkübe edin. DNA örneğine boncuk 2 hacim ilave edin ve 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de çözelti inkübe edilir. </li><li> 5 dakika için bir ayrıştırma mıknatıs üzerine numuneler ve süpernatant atılır. 200 uL taze% 80 etanol (EtOH) ile iki kez boncuk yıkayın. Hava, 10 dakika boyunca taneciklerin kurutulması. </li><li> ayırma mıknatıs örnekleri çıkarın ve elüsyon tamponu (EB) 50 mcL, pipetleme ile karıştırın. </li><li> daha sonra tekrar 3 dakika için ayrılma mıknatıs üzerine örnekleri yer, 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de süspansiyon inkübe edin. </li><li> Trtemiz bir tüpe DNA içeren süpernatant, ansfer. boncuk atın. </li><li> Dördüncü bölümde uyarınca saflaştırılmış DNA niceliğini. </li></ol> Saflaştırılmış DNA 4. Niceleme Not: Saflaştırılmış DNA, bir florimetre ve üreticinin talimatları izlenerek, çift sarmallı (dsDNA) yüksek duyarlılık (SS) deneyi kiti kullanılarak ölçülmüştür. <ol><li> reaktiftir tamponu: 1 oranını 199 kullanarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> çalışma çözeltinin 190 mcL her DNA standardının 10 mcL ekleyin. </li><li> çözümü çalışma 190 mcL saflaştırılmış DNA 10 uL ekleyin. Nihai hacim 200 ul olmalıdır. 2 dakika boyunca 23 ° C&#39;de, standart ve DNA örnekleri inkübe edin. </li><li> Ekrandaki yönergeleri kullanarak florometrede DNA örnekleri daha önce standartları analiz edin. </li></ol> 5. Shotgun Sıralama Kütüphane Hazırlık NOT: av tüfeği sıralama kütüphanesi kullanılarak hazırlanmıştırÜreticinin talimatlarını kullanarak ticari kütüphane hazırlık seti. <ol><li> 0.2 ng / ml kullanarak EB DNA örnekleri sulandırmak. Bu konsantrasyonun altında olan herhangi bir örneği, negatif kontrol, yani, mevcut konsantrasyonda bırakılır. </li><li> tampon ve 5 uL enzim karışımı 10 uL saflaştırılmış DNA 5 ul karıştırın. 5 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> tampon nötralize 5 uL ilave edin ve 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de çözelti inkübe edilir. </li><li> Örnek özel sıralaması endekslerinin her 5 uL ve 15 uL PCR ana karışımı ekleyin. </li><li> bir PCR, 10 s, 30 s boyunca 55 ° ve 30 saniye için 72 C, 95 ° C 12 döngü önce 3 dakika, 30 saniye süreyle 95 ° C, 72 ° C&#39;de numune inkübe edin. 5 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son örnekleri inkübe edin. </li><li> daha önce olduğu gibi, ancak EB 30 uL nihai elüsyon ile topuk kısmı arıtma ile hazırlanan DNA saflaştırılır. </li></ol> 6. Library Miktar ve Kalite Kontrol NOT: hazırlanmış kütüphanelerin miktarı ve kalitesi ticari bir kit ve cihazlar kullanılarak değerlendirildi. <ol><li> kullanımdan önce, 30 dakika boyunca 23 ° C&#39;de kitleri inkübe edin. </li><li> 2,000 rpm&#39;de 1 dakika için tampon ve vorteks 2 uL DNA 2 ul ekleyin. </li><li> o tüpün dibinde olduğundan emin olmak için numune aşağı doğru döndürün. </li><li> aracı haline örnek tüpleri, analiz bandı ve ipuçları takın ve yazılım tarafından yönlendirildiği gibi analizi gerçekleştirmek. </li></ol> 7. Adı geçen DNA Sekanslama <ol><li> 300 bp eşleştirilmiş uç sıralama 45 kullanarak bir sıralama servis ve diziye hazırlanan ve sayısal DNA dizileme kütüphaneleri örnekleri aktarın. </li></ol> Ham Sıra Verilerin 8. Analiz NOT: Linux işletim sistemini kullanan her program için komutlar protokol adımı aşağıda gösterilmiştir. s için kullanılan boru hattıSequence veri analizi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. programlar analizden önce kullanıcı tarafından monte edilmelidir. Bu işlem, her bir örnek için tek tek gerçekleştirilmelidir. <ol><li> Analiz ve ileri ardından komut satırı / yol Dosyaya / fastqc için yazarak FastQC 46 kullanılarak DNA dizisi veri görselleştirmek ve ham raw_read1.fastq raw_read2.fastq okur ters. </li><li> -o output_fastqc ve -f fastq ham okuma dosyalarının dosya biçimini yazarak bir çıkış klasörü belirtin. </li><li> Çıktı dosyası (Şekil 2) görüntüleyin. yol Dosyaya / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Kalite Kontrol Kesme ve Filtreleme Sıra Veri <ol><li> Komut satırı java-jar / yol Dosyaya / trimmomatic-0.35.jar içine yazarak kırpma programı, Trimmomatic 28 çalıştırın. </li><li> Belirtin dosyalar &#39;PE&#39; yazarak uç dosyaları eşleştirilmiş. Devlet bu 16 merkez processing birimi (CPU) -threads 16 yazarak program tarafından kullanılmalıdır. </li><li> Ham ileri isimlerini yazarak QC kontrolüne iki dosyaları listelemek ve okur ters. çıkış dosyalarının önek -baseout Silaj yazarak belirlenir. </li><li> ILLUMINACLIP yazarak program seçenekleri tanımlayın: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LİDERİ: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 ÜRÜN: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36. </li><li> Tamamlandığında, daha önce olduğu gibi FastQC kullanılarak kesilmiş dizileri analiz ve başarılı yapılmıştır kırparak sağlamak için ham dizi verilerine çıktı karşılaştırın. NOT: yazılım aracı, Trimmomatic, önde gelen düşük kaliteli veya N üsleri kaldırarak daha okur kesilmiş (aşağıda kaliteli 3), düşük kaliteli veya N üsleri firar kaldırma (aşağıda kalite 3) ve her bir 4-baz geniş sürgülü pencere okumak taramaları yapılabilir. parametreler tabanı başına ortalama kalite herhangi 36 baz uzunluğunda altına okur düşmesi daha sonra 20 altına düşerse ve ne zaman kesmek için kuruldu. Son olarak, 15 baz FR kesilmiş edildiom her başkanı okumak ve okuma başından itibaren 200 üsleri korumak için kırpılmış edildi okur. Bu son adım, uzun sequencing zaman bazı kalite sorunları aşmak için yapıldı (&gt; 200 bp) okur. Bu özel örneklerin 28 için ayarlanabilir. java-jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout silaj ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LİDERİ: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 ÜRÜN: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36 </li></ol> 10. metagenome Meclisi <ol><li> , Eşleşmemiş kesilmiş Birleştirme eşleşmemiş okur tarafından takip kedi yazarak okur; silage_read2_unpaired.fastq silage_read1_unpaired.fastq. yazarak yeni bir dosya dosyaları yazın&gt; silage_merged_unpaired.fastq cat silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> De novo sıralı DNA monte etmek için, yazarak / yol-to tarafından kollar (St. Petersburg genom montajcı) 30 kullanın-dosya / spades.py. 16 CPU&#39;lar --meta yazarak uygulanan gereken metagenomic parametresi 16 t yazarak ve kullanılacak olduğunu belirtin. </li><li> ileri kesilmiş tanımlamak kullanarak -1 silage_read1_paired.fastq okur ve ters -2 silage_read2_paired.fastq tarafından okur. Birleştirilmiş çiftlenmemiş -s silage_merged_unpaired.fastq tarafından belirlenir okur. </li><li> silage_spades -o yazarak çıkış klasörü tanımlayın. yol Dosyaya / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. Eşli uç Oku Bindirme <ol><li> DNA dizisinin çiftleri komut satırı / yol Dosyaya / flash içine yazarak FLAŞ (Short hızlı Uzunluğu Ayarı okur) 29 kullanılarak okur Birleştirme. 16 CPU&#39;lar Silaj -o yazarak 16 ve çıkış öneki -t kullanılarak kullanılması gerektiğini belirtin. </li><li> kesilmiş tespit silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq yazarak okur yol Dosyaya / flaş 1 -t6 -o silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq parladı </li></ol> 12. Taksonomik Sınıflandırma <ol><li> Tür / yol-dosya / kraken ve / yol Dosyaya / standart --db yazarak veritabanını belirtin. </li><li> 16 CPU&#39;lar --threads 16 yazarak kullanılması gerektiğini tanımlamak ve FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt --output kullanarak bir çıkış klasörü tanımlamak. girdi dosyasının adını yazın; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq yol Dosyaya / kraken --db standart --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOT: Kraken 7 kullanılarak monte DNA dizisi iskelelerinin sınıflandırılması mevcut tüm Prokaryot genom dizileri içeren en son standart Kraken veritabanı karşı tamamlandı. </li><li> -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int kesim yazarak çıktı dosyası ve yeni bir dosya aktarma kolonlar 2 ve 3 </li><li&gt; Web tarayıcısında çıktı dosyasını açın. -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int kesilmiş </li><li> KtImportTaxonomy yazarak Kronu 12 içine yeni bir dosya aktarın. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int yazarak giriş dosyası belirtin. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html -o yazarak çıkış dosyası belirleyin. yol Dosyaya / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. Fonksiyonel Notu <ol><li> MG-RAST 47 web sitesi, http://metagenomics.anl.gov/ gidin. Gerekirse yeni bir kullanıcı olarak kayıt. Giriş yaptıktan sonra, &quot;Yükle&quot; butonuna tıklayın. Adım 10 monte iskeleleri yükleyin. </li><li> Dosyaları yükledikten sonra, &quot;Gönder&quot; ve talimatları izleyin tıklayın ve analiz tamamlanmasını bekliyor. </li><li> Analiz tamamlandıktan sonra, em yoluyla gönderilen linki görmekMG-RAST dan veya alternatif ail, &quot;İlerleme&quot; üzerine tıklayın. tamamlanan işlerin bir listesi vardır. İlgili iş kimliği ve ardından &quot;indirme sayfasına&quot; bağlantısına tıklayın. </li><li> indirme sayfasında, başlığı &quot;Protein Kümelenme% 90&quot; başlığı altında, 550.cluster.aa90.faa tahmin protein dosyasını indirmek için protein butonuna tıklayın. </li><li> Olarak varsayımsal belirli bir cazy enzim sınıfa ait proteinleri sınıflandırmak için, cazy veritabanına 48 indirilen proteinleri karşılaştırın. dosyalarından enzim karbonhidrat-aktif veritabanı (cazy) indirin şunlardır: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip ve PL.zip. Bu dosyalar sırasıyla aşağıdaki enzim sınıfları temsil: Yardımcı Etkinlikler (AA), Karbonhidrat esterazlar (CE), glikosid hidrolazlar (GH), Glukozil transferazlar (GT) ve Polisakarit Liyazlar (PL). </li><li> veritabanı dosyaları halletmek ve USEARCH UBLAST ALGOR kullanarak cazy veritabanı proteinleri protein benzerliği belirleyerek proteinleri açıklamaithm 49. 5 veritabanı .txt dosyaları tip yineleme yapmak (* .txt olarak i için) bash döngü kullanmak için &quot;* .txt olarak i için; yapmak&quot;. </li><li> ublast algoritmasını kullanmak için parametre -ublast ile yazarak / yol Dosyaya / usearch8 tarafından USEARCH çalıştırın. Sonra MG-RAST, &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot; indirilen protein dizi dosyasının adını yazın. </li><li> Veritabanı dosyasını belirtmek için &quot;$ i -DB&quot; ve 1e -5 ° e-değer eşiği belirlemek için tipini, türünü &quot;-evalue 1e-5&quot; kullanılacak. </li><li> Bir hedef dizinin bulunmasından sonra aramayı sona erdirmek ve bu nedenle, hedef enzim sınıfına, örneğin, GH, tip 1 &quot;-masaccepts&quot; ait olarak, protein sekansı sınıflandırmak için. </li><li> 16 CPU&#39;lar türü kullanılan &quot;16 -threads&quot; ve atab ayrılmış metin türü &quot;-blast6out&quot; olarak çıktı dosyasının formatını belirtmek için gerektiğini tanımlamak için kullanılır. Çıktı dosya türü &quot;$ i.ublast&quot; tanımlamak için. t, bash döngü sona erdirmek içinYPE &quot;; done&quot; * .txt Olarak i; do / yol Dosyaya / i -evalue usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -DB $ 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 $ i.ublast -blast6out; tamam </li></ol> 14. görselleştirme cazy Açıklaması <ol><li> bash döngü kullanarak her enzim sınıfı için protein kimliği listeleri, bir Venn diyagram olarak cazy açıklama çıkışı görselleştirmek oluşturmak için. &quot;* .ublast Içinde i için; yapmak&quot; yazın. </li><li> Çıktı dosyası ve yeni bir dosyaya sütun 1 aktarmak için yazın &quot;kedi $ i | -f 1&gt; $ i.list kesti&quot;. </li><li> döngü ve türünü sonlandır &quot;; done&quot;. </li><li> bir metin editörü .list dosyaları açın. , Web sitesine gidin 5 gibi set sayısını seçmek ve ayrı bir kutuda her liste dosyasının içeriğini yapıştırın. Bir .SVG dosyası olarak ortaya çıkan şeması indirin. i * .ublast en çok; Kedi $ i do | kesme -f 1&gt; $ i.list; tamam </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Siliko analizinde bir çevresel örneklerin içinde mevcut olan mikrobiyal topluluklar için mükemmel bir fikir verebilir iken, taksonomik sınıflandırmaların ilgili kontroller ile birlikte ve sıralama uygun bir derinlik bütününü yakalamak için elde edildiğini yapılabilir göstermiştir kritik olduğunu 51 mevcut nüfus. herhangi bir hesaplama analizi ile, benzer bir hedefe ulaşmak için birçok yollar vardır. Bu çalışmada kullanılan metodlar silaj mikrobiyomları üzerinde analizler bir dizi elde etmek için bir araya getirildi uygun ve basit yöntemler, örnekleridir. Çeşitli ve biyoinformatik araçları ve teknikleri giderek artan sayıda örneği Phylosift 8 ve MetaPhlAn2 52 için, metagenomic verileri analiz etmek için kullanılabilir ve bu numunenin kendi alaka soruşturma ve analiz req öncesinde değerlendirilmelidir53 edinilmiş. Metagenomic analiz yöntemleri sınıflandırma, sıralama derinliği ve sıralama kalitesi için kullanılabilir için veritabanları ile sınırlıdır. Burada gösterilen biyoinformatik işleme yerel, yüksek enerjili makinede yapıldı; Ancak bulut tabanlı sistemler de mevcuttur. Bu bulut tabanlı hizmetler, uygun bir güçlü yerel iş istasyonunda yüksek maliyetli yatırımı kalmadan gerekli hesaplama gücü kiralama için izin verir. Bu yöntemin bir potansiyel uygulama bu nedenle gıda zincirine girmesini engel hiçbir zararlı bakteri mevcut olduğundan emin olmak için tarımda kullanılmadan önce silaj değerlendirmek olacaktır.

Metagenomiks DNA&#39;nın doğrudan analizi çevre örnekleri 1 içinde bulunan biyolojik toplulukların saflaştırılmış ve ilk sediment 2&#39;de bulunan Kültüre edilemeyen bakteri tespit etmek için kullanılır idi. Metagenomiks yaygın olarak, insan mikrobiyomu 3 belirleme okyanus 4 içinde ve hatta kahve makineleri 5 üzerinde geliştirmek bakteri topluluklarının analizi için mikrobiyal nüfusu sınıflandırılması gibi uygulamalar, bir dizi için kullanılır olmuştur. Yeni nesil dizileme teknolojileri tanıtılması büyük sıralama hacmi ve çıkış sonuçlandı. Sonuç olarak, DNA dizilemesi, 6 daha ekonomik hale gelmiştir ve gerçekleştirilebilir sekanslama derinliği büyük ölçüde güçlü bir analitik araç haline metagenomics sağlayan artmıştır. Metagenomic sıralama pratik, moleküler açıdan &quot;Front-end&quot; geliştirmeleri in büyümesini tahrik vartaksonomik sınıflandırma 7-9, fonksiyonel açıklama 10,11 ve DNA sekans verileri görsel temsilini 12,13 kullanılabilir siliko biyoinformatik araçları. Mevcut sayısının artması, kaçınılmaz sıralı genomları 15 bir &quot;arka uç&quot; referans veritabanı karşı gerçekleştirilen mikrobiyal topluluklar, sınıflandırılmasında daha hassasiyet sağlayan prokaryotik ve ökaryotik 14 genomları sıralı. Iki temel yaklaşım metagenomic analiz için kabul edilebilir. Daha geleneksel bir yöntem, bakteriyel genom bölgesini kodlayan 16S rRNA geninin analizidir. 16S rRNA yüksek prokaryot türler arasında korunmuş ancak dokuz hiper-değişken bölgeleri sergiler (V1 - V9) türleri tanımlama 16 için istismar edilebilir. uzun dizileme giriş (≤ 300 bp eşleştirilmiş sonu), özellikle de iki hiper değişken bölgeleri kapsayan DNA sekanslarının analizi için izinV3 - V4 bölgesi 17. Böyle Oxford Nanopore 18 ve PacBIO 19 gibi diğer sıralama teknolojileri, ilerlemeler tüm 16S rRNA gen bitişik sıralı izin yoktur. 16S rDNA göre kütüphaneleri türlerin belirlenmesi için hedeflenen bir yaklaşım sağlar ve doğal saflaştınlmış numuneler içinde meydana düşük kopya sayısı DNA algılanmasını sağlamak da, av tüfeği sıralama kütüphaneleri ya da 16S çoğaltılabilir olmayan DNA bölgeleri içerebilir türlerinin tespiti için izin rRNA işaretleyici astar dizileri kullanılan, ya da şablon dizisi ve yükseltme primer dizisinin arasındaki farklar 20,21 çok büyük çünkü. DNA polimerazlar, DNA replikasyon yüksek aslına olmasına rağmen başka, taban hataları yine PCR amplifikasyonu sırasında oluşabilir ve bu dahil hataları türler 22 menşeli hatalı sınıflandırma ile sonuçlanabilir. Şablon SEQ PCR amplifikasyonu ayrımcıDİZİLERİ da oluşabilir; Kullanılan nihai amplikon, havuzda gibi timin glikol gibi 23 ve benzer şekilde, doğal olmayan baz modifikasyonları temsil altında yüksek bir GC içeriğine sahip DNA dizileri, DNA polimeraz 24 dizileri DNA&#39;nın çoğaltılmasında hatalarına neden durdurmak için olabilir. Buna karşılık, bir av tüfeği sıralama DNA kütüphanesi bir numune çıkarılır ve daha sonra önceden sekanslama için hazırlık için daha kısa DNA zinciri uzunluklarda parçalanmış olan saflaştırılmış DNA tümü kullanılarak hazırlanmıştır bir DNA kütüphanesidir. Finansal maliyet güvenilir bir dizi derinliği amplikon sekanslama 26 daha büyüktür ulaşmak için gerekli olsa da tüfek dizilemesi ile oluşturulan DNA dizilerinin taksonomik sınıflandırma, 16S rRNA dizilemesi amplikon 25 daha doğru karşılaştırılır. av tüfeği sıralama Metagenomiks büyük yararı olmuştur kez numune çeşitli genomlar sıralı bölgeleri gen zenginleştirilmesi için kullanılabilir olmasıdırtaksonomik 27 sınıflandırılmıştır. Metagenomic dizi verileri biyoinformatik araçlar giderek artan aralığı ile analiz edilir. Bu araçlar, örneğin, uygulamalar geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için edebiliyoruz, eşleştirilmiş ucunun üst üste ham dizi verilerinin 28 kalite kontrol analizleri, dizinin de novo montaj komşularla ve iskeleler 30,31, taksonomik sınıflandırma ve görselleştirme okur 29 okur dizisi okur ve dizileri 7,12,32,33 ve monte dizilerin 34,35 fonksiyonel ek açıklama toplandı evi. Mısır gibi fermente tahıllar (Zea mays) dan dünya çapında çiftçiler tarafından üretilen silaj, ağırlıklı olarak büyükbaş hayvan yemi olarak kullanılır. Silaj bakteri Lactobacillus sp ile işlenir. fermantasyon 36 yardım ancak bugüne kadar, silaj bulunan diğer mikrobiyal populasyonların sınırlı bilgi var etmek. Fermentn süreci silaj 37 içinde yaygın hale istenmeyen ve zararlı mikro-organizmaların yol açabilir. Maya ve küf ek olarak, bakteri silaj fermente anaerobik ortam yapılarına uyarlanabilir ve daha sık çiftlik hayvanlarında hastalıkların yerine silaj 38 bozulması ile ilişkilidir. Silaj siloları doldurma ve böylece silaj 39 pH artan bütirik asit, laktik asit, anaerobik sindirim ürünü dönüştürmek mümkün olduğunda yanlışlıkla topraktan eklenebilir bütirik asit bakterileri kalır. PH bu artış normal, optimum silaj fermantasyon koşulları 38 altında büyümeyi sürdürmek mümkün olacağını bozucu bakterilerin bir yükselişe yol açabilir. Clostridium spp. Listeria spp. ve Bacillus spp. Gastr hayatta bakteri sporlarına olarak, özellikle süt sığırı yemi silajında, özel bir önem taşıyorointestinal yolu 40 hayvan ve insan ölümlerine 37,39,41-44 için, nadir durumlarda, gıda zinciri girmek gıda bozulmaları yol ve olabilir. o silaj bozulma nedeniyle veteriner tedavisi ve hayvancılık kaybının tam ekonomik etkilerini tahmin etmek zor Dahası, bir salgın meydana gelmesi ise bir çiftlik zararlı olması muhtemeldir. Metagenomic yaklaşım kullanarak biz olmak iyileştirici önlemler sağlayan, silaj örneklerinde mevcut mikrobiyal nüfusu sınıflandırmak ve ayrıca da, potansiyel olarak hayvancılık üzerinde zararlı bir etkisi olurdu silaj bozulma ile ilişkili mikrobiyal topluluklar belirleyebilir varsayılmaktadır silaj önce alınan bir besin kaynağı olarak kullanılmak üzere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FastDNA SPIN Kit for Soil</td>
			<td style="width:128px;">MP Bio</td>
			<td style="width:120px;">116560200</td>
			<td style="width:301px;">DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNA FastPrep</td>
			<td style="width:128px;">MP Bio</td>
			<td style="width:120px;">116004500</td>
			<td>DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:128px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:120px;">A63880</td>
			<td>DNA Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elution Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">19806</td>
			<td>DNA Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:120px;">Q33216</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:120px;">Q32854</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nextera XT DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;">FC-131-1024</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;">FC-131-1001</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TapeStation 2200</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">G2964AA</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HS D100 ScreenTape</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5584</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HS D100 ScreenTape Reagents</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5585</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TapeStation Tips</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5153</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TapeStation Tubes</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">401428 and 401425</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High Power Analysis Workstation</td>
			<td style="width:128px;">Various</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>Local or cloud based, user preferred system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Biyoinformatik işleme önce, çiğ dizisi kesilmiş edildi okur ve adaptörler Trimmomatic yazılımı 28 kullanılarak uzaklaştırıldı. Kesme ve süzme aşamasından sonra, sırayla% 50 düşürülmüştür okuma sayısı (Tablo 1) okur. Ortalama taban phred puanı (Şekil 2) kalite kontrolden geçtikten sonra&gt; 30 idi. Örtüşen bölgelerde tek uzun okur oluşturmak için FLASH yazılımı 29 kullanılarak birleştirildi vardı DNA dizilerinin çiftleri, örtüşmeyen ayrı bir dosyada tutuldu okur. 45.47% başarılı bir şekilde birleştirilebileceğini (105.343) okur. Üst üste binmesini takiben ortaya çıkan genişletilmiş fragmanlar Kraken yazılımını 7 kullanarak bakteriyel taksonomik sınıflandırma yapıldı ve daha sonra Kronu yazılımı (Şekil 3) ile görüntülendi, okur FLASH kullanarak okur. <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; silaj metagenome mevcut bakteri türlerinin çoğunluğu 4 prokaryotik filumlar içinde bulunan: Firmicutes (% 34), Actinobacteria&#39;lar (% 28), proteobakteride (% 27) ve Bacteroidetes (% 7) . Bu filumlar içinde mevcut sınıflarının dağılımı Şekil 4&#39;te görülebilir. Metagenome en bol türler Lactobacillus spp. (% 24; Firmicutes), Corynebacterium spp. (% 8, Actinobacteria&#39;lar) Propionibakteri türleri. (% 3; Actinobacteria&#39;lar) ve Prevotella spp. (% 3; Bacteroidetes). hastalığa yol açan hayvan sağlığı için önemli ve türleri de gözlenmiştir; Clostridium spp. (% 1), Bacillus spp. (% 0.6), Listeria spp. (% 0.2) silaj numunede mevcut olduğu tahmin edildi. Fonksiyonel açıklama okur monte gerçekleştirildi. Metagenome kesilmiş ve filtre kullanarak Maça assembler 30 kullanılarak toplandıpaired-end ve eşleştirilmemiş 92284 iskele üreten okur. selülaz tanımlamak için, proteinler MG-RAST kullanılarak tahmin ve enzim karbonhidrat-aktif veritabanı (cazy) kullanılarak açıklamalı bulundu. 97.562 tahmin edilen protein arasında, 6357 cazy veritabanı (Şekil 5) oluşturan beş enzim sınıflarından birinde varsayımsal karbohidrat aktif enzim olarak bilgi notları eklendi. Sonuçlar birden fazla cazy enzim sınıfı ek açıklama içeren olanlar da dahil, protein ek açıklamalar dağılımını gösteren InteractiVenn yazılımını 50 kullanarak bir Venn diyagramı olarak görüntülendi. Bunlardan, 3861 glikozit hidrolaz aktivitesi için tahmin edilen ve daha fazla işlevi onaylamak için laboratuarda karakterize edilecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Şekil 1: Silaj Analizi için Biyoinformatik Metagenomiks Boru Hattı. Iki temel yaklaşım vardısilaj, taksonomik sınıflandırma ve fonksiyonel ek açıklama mikrobiyomları araştırmak için kullanılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Şekil 2: Önce tabanı Başına ve Kırpma ve Adaptör Temizleme sonra Dizisi kalitesi. FASTQC dan başına tabanı dizisi kalitesi arsa dizisinin uzunluğu boyunca ortalama phred skor öncesi ve sonrası kalite kontrol okur gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Şekil 3: Taksonomik sınıflaKatı Silaj bakteriyel mikrobiyomu bir yon. FLASH Kraken 7 kullanılarak gerçekleştirildi ve daha sonra kronu ile görüntülendi gelen kesilmiş ve üst üste dizinin sınıflandırılması okur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Şekil 4: Katı Silaj bakteriyel mikrobiyomu 4 En Bol şubelerinin taksonomik Sınıf Dağılımı. Dört en bol filum içinde bakteri her sınıfın yüzdesi. Firmicutes: Clostridia (kırmızı) ve Basiller (koyu mavi); Proteobacteria: delta / epsilon (pembe), alfa (mavi soluk), gama (turuncu) ve beta (turkuaz); Bacteroidetes: Flavobacteriia (koyu mavi) ve Bacteroidia(soluk yeşil); Actinobacteria&#39;lar: Coriobacteriia (koyu mor) ve diğer Actinobacteria&#39;lar (koyu yeşil). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Şekil 5: Katı Silaj mikrobiyomu içinde Öngörülen Proteome cazy Açıklaması. Katı silaj mikrobiyomları tahmin proteom cazy açıklamalarla beş enzim sınıflarının dağılımını gösteren Venn şeması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Ham okur </td><td rowspan="2"> # Filtreli okur (eşli) </td&gt; <td> # Filtreli okur </td><td rowspan="2"> # Okur parladı </td></tr><tr><td> (Eşli) </td><td> (Çoklu) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1.892.534 </td><td> 105.343 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Dizileme Özeti Tablosu okur.

Watch this Scientific Journal Video about Metagenomic Analysis of Silage at JoVE.com

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Yemlerin metagenomic Analizi

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

18.0K Görüntüleme.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Video: Metagenomic Analysis of Silage

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Genetik

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here is a powerful experimental approach for analyzing the transcription termination defect under physiological conditions. Like the traditional TRO assay, it relies on the presence of a transcriptionally active polymerase beyond the 3&#8242; end of the gene as an indicator of a transcription termination defect1. It overcomes two major problems encountered with the traditional TRO assay. First, it can detect if the polymerase reading through the termination signal is the one that initiated transcription from the promoter-proximal region, or if it is simply representing a pervasively transcribing polymerase that initiated non-specifically from somewhere in the body or the 3&#8242; end of the gene. Secondly, it can distinguish if the transcriptionally active polymerase signal beyond the terminator region is truly the readthrough sense mRNA transcribing polymerase or a terminator-initiated non-coding anti-sense RNA signal. Briefly, the protocol involves permeabilizing the exponentially growing yeast cells, allowing the transcripts that initiated in vivo to elongate in the presence of the BrUTP nucleotide, purifying BrUTP-labelled RNA by the affinity approach, reverse transcribing the purified nascent RNA and amplifying the cDNA using strand-specific primers flanking the promoter and the terminator regions of the gene2.

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...