Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Emplacement du site <ol><li> Recueillir l&#39;échantillon d&#39;ensilage à partir d&#39;un site approprié, comme une ferme. Ici, la ferme était située dans Ballydulea, Co. Cork, Irlande (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. Extraction de l&#39;ADN REMARQUE: L&#39;extraction d&#39;ADN a été réalisée à l&#39;aide d&#39;un kit commercial en suivant les instructions du fabricant. Un contrôle négatif, qui ne contient pas l&#39;échantillon, a été utilisé dans le procédé de préparation de la bibliothèque. <ol><li> Ajouter 1-400 mg d&#39;échantillon de 978 ul de tampon phosphate de sodium et le tampon de lyse du sol 122 pi dans des tubes de lyse fournis. </li><li> Homogénéiser les échantillons en plaçant les tubes de lyse dans l&#39;homogénéiseur pendant 40 s à une vitesse de 6,0 m / s. </li><li> lysats Centrifugeuse à 14.000 xg pendant 15 minutes et transférer le surnageant dans un tube de micro-centrifugeuse propre contenant 250 pi de protéine Précipité Solution (PPS). Mélanger la solution en retournant de 10 fois et centrifugerà 14.000 xg pendant 5 min. </li><li> Ajouter le surnageant à 1 matrice de liaison d&#39;ADN mL dans un ml tube de centrifugeuse propre 15. Mélanger la solution en retournant le tube en permanence pendant 3 min. Laisser le mélange reposer pendant 3 min, puis défaussez 500 pi de surnageant. Mélanger le surnageant restant. </li><li> Transférer 600 ul de la suspension à un filtre et centrifuger à 14000 xg pendant 1 min. Jeter le filtrat et répétez le processus avec la suspension restante. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lavage à la matrice de liaison d&#39;ADN dans le filtre de spin, mélanger par pipetage, puis centrifuger à 14 000 xg pendant 1 min. </li><li> Jeter le filtrat et centrifuger à nouveau le filtre centrifuge à 14.000 xg pendant 2 min pour assurer tout le tampon de lavage est éliminé. Sécher le filtre rotatif à 23 ° C pendant 5 min. </li><li> Pré-chaud (70 ° C) l&#39;eau DNase (DES) et re-suspendre la matrice de liaison d&#39;ADN dans 100 ul du DES dans le filtre de spin. Transférer le filtre rotatif à un nettoyage de 1,5 ml de micro-centrifugeuse tuêtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 1 min à éluer l&#39;ADN. Conserver l&#39;ADN purifié à -20 ° C jusqu&#39;à nouvel analyse est effectuée. </li></ol> 3. Purification d&#39;ADN Perles de purification utilisant de l&#39;ADN REMARQUE: Avant la préparation de la bibliothèque metagénomique On a purifié l&#39;ADN extrait en utilisant des billes de purification pour obtenir un échantillon d&#39;ADN pur a été obtenu. <ol><li> Incuber les billes à 23 ° C pendant 30 min avant utilisation. Ajouter 2 volumes de perles de l&#39;échantillon d&#39;ADN et faire incuber la solution à 23 ° C pendant 5 min. </li><li> Placer les échantillons sur un aimant de séparation pendant 5 min, puis jeter le surnageant. Laver les billes deux fois avec 200 ul d&#39;éthanol frais à 80% (EtOH). Sécher à l&#39;air les perles pendant 10 minutes. </li><li> Retirer les échantillons de l&#39;aimant de séparation et ajouter 50 pi de tampon d&#39;élution (EB), mélanger par pipetage. </li><li> Incuber la suspension à 23 ° C pendant 5 min, après quoi placer les échantillons en arrière sur l&#39;aimant de séparation pendant 3 min. </li><li> Transfert le surnageant, qui contient l&#39;ADN dans un tube propre. Jeter les perles. </li><li> Quantifier l&#39;ADN purifié conformément à la section quatre. </li></ol> 4. Quantification de l&#39;ADN purifié NOTE: L&#39;ADN purifié a été quantifiée en utilisant un fluorimètre et double brin (ADNdb) haute sensibilité (HS) kit de dosage suivant les instructions du fabricant. <ol><li> Préparer une solution de travail à l&#39;aide de 199: 1 d&#39;un tampon de réactif. </li><li> Ajouter 10 pi de chaque norme d&#39;ADN à 190 pi de solution de travail. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;ADN purifié à 190 ul de la solution de travail. Le volume final doit être de 200 pi. Incuber échantillons standards et d&#39;ADN à 23 ° C pendant 2 min. </li><li> Analyser les normes avant que les échantillons d&#39;ADN sur le fluorimètre en utilisant les instructions à l&#39;écran. </li></ol> 5. Shotgun Sequencing Bibliothèque Préparation REMARQUE: La bibliothèque de séquençage aléatoire a été préparé à l&#39;aide d&#39;unKit de préparation de la bibliothèque commerciale en utilisant les instructions du fabricant. <ol><li> Diluer les échantillons d&#39;ADN à 0,2 ng / ul utilisant EB. Tout échantillon qui est déjà en dessous de cette concentration, à savoir le contrôle négatif, est laissé à sa concentration actuelle. </li><li> Mélanger 5 pi de l&#39;ADN purifié avec 10 pi de tampon et 5 pi mélange enzymatique. Incuber les échantillons à 55 ° C pendant 5 min. </li><li> Ajouter 5 pi de tampon de neutralisation et incuber la solution à 23 ° C pendant 5 min. </li><li> Ajouter 5 ul de chacun des indices des échantillons de séquençage spécifiques et 15 ul de mélange maître de PCR. </li><li> Dans un thermocycleur, incuber les échantillons à 72 ° C pendant 3 min, 95 ° C pendant 30 s, avant 12 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s. Incuber échantillons enfin à 72 ° C pendant 5 min. </li><li> Purifier l&#39;ADN préparé à l&#39;aide de la purification de perles comme avant, mais avec une élution finale de 30 pi de EB. </li></ol> 6. LQuantité ibrary et Contrôle de la qualité NOTE: La quantité et la qualité des bibliothèques préparées ont été évaluées à l&#39;aide d&#39;un kit commercial et de l&#39;instrumentation. <ol><li> Incuber les composants du kit à 23 ° C pendant 30 minutes avant utilisation. </li><li> Ajouter 2 ul d&#39;ADN à 2 ul de tampon et vortex pendant 1 min à 2000 tours par minute. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon pour assurer qu&#39;il se trouve au fond du tube. </li><li> Insérez les tubes d&#39;échantillons, la bande d&#39;analyse et des conseils dans l&#39;instrument, et effectuer des analyses selon les instructions du logiciel. </li></ol> 7. séquençage de l&#39; ADN <ol><li> Transférer les bibliothèques de séquençage d&#39;ADN des échantillons préparés et quantifiés à un service et la séquence en utilisant le séquençage de 300 pb fin jumelé séquençage 45. </li></ol> 8. Analyse des premières données de séquence NOTE: Les commandes pour chaque programme en utilisant un système d&#39;exploitation Linux sont présentés ci-dessous l&#39;étape du protocole. Le pipeline utilisé pour sl&#39; analyse des données equence est représenté sur la figure 1. Les programmes doivent être installés par l&#39;utilisateur avant l&#39;analyse. Ce processus doit être effectué individuellement pour chaque échantillon. <ol><li> Analyser et visualiser les données de séquence d&#39;ADN en utilisant FastQC 46 en tapant la ligne de commande / path-to-file / fastqc, suivie par la marche avant et arrière lectures brutes raw_read2.fastq raw_read1.fastq. </li><li> Spécifiez un dossier de sortie en tapant output_fastqc -o et le format de fichier des fichiers lus premières par fastq -f. </li><li> Voir le fichier de sortie (Figure 2). path-to-file / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Contrôle de la qualité Parage et filtrage de données de séquence <ol><li> Exécutez le programme de détourage, Trimmomatic 28 en tapant dans la ligne de commande java -jar / path-to-file / trimmomatic-0.35.jar. </li><li> Spécifiez les fichiers sont jumelés fichiers finaux en tapant «PE». Etat 16 pr centraleunités ocessing (CPU) doivent être utilisés par le programme en tapant -threads 16. </li><li> Lister les deux fichiers au QC chèque en tapant les noms de la première avant et arrière se lit. Le préfixe des fichiers de sortie est déterminée en saisissant l&#39;ensilage -baseout. </li><li> Définir les options pour le programme en tapant ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 CULTURE: 200 HEADCROP: 15 minlen: 36. </li><li> Une fois terminée, l&#39;analyse des séquences à l&#39;aide FastQC parés comme précédemment et comparer la sortie des premières données de séquence afin d&#39;assurer la coupe a été réalisée avec succès. REMARQUE: L&#39;outil logiciel, Trimmomatic, rognée lit encore en enlevant menant faible qualité ou N bases (ci-dessous la qualité 3), la suppression de fuite de faible qualité ou N bases (ci-dessous la qualité 3) et la numérisation chaque lecture avec une fenêtre coulissante large 4-base. Les paramètres ont été définis pour la coupe lorsque la qualité moyenne par base tombe en dessous de 20, puis de laisser tomber tout se lit en dessous de 36 bases de long. Enfin, 15 bases ont été recadrées from la tête de chaque lecture et lectures ont été coupés pour maintenir 200 bases depuis le début de la lecture. Cette dernière étape a été réalisée pour surmonter certains problèmes de qualité lorsque le séquençage à long (&gt; 200 pb) lit. Ceux - ci peuvent être ajustés pour des échantillons spécifiques 28. java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq ensilage -baseout ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 CULTURE: 200 HEADCROP: 15 minlen: 36 </li></ol> 10. Assemblée Metagénome <ol><li> Fusionner le apparié, rognée lit en tapant cat suivi par le apparié lit; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Écrivez les fichiers dans un nouveau fichier en tapant&gt; silage_merged_unpaired.fastq cat silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Pour de novo assembler l&#39;ADN séquencé, utilisez Spades (Saint - Pétersbourg génome assembleur) 30 en tapant / path-to-file / spades.py. Précisent que les 16 processeurs doivent être utilisés en tapant -t 16 et que le paramètre doit metagénomique appliqué en tapant --meta. </li><li> Identifier les rognée avant lit en utilisant -1 silage_read1_paired.fastq et l&#39;inverse se lit par -2 silage_read2_paired.fastq. La apparié fusionnée lit sont spécifiés par silage_merged_unpaired.fastq -s. </li><li> Définir le dossier de sortie en tapant -o silage_spades. path-to-file / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. Couplé-end Lire Overlap <ol><li> Fusionner paires de séquence d&#39;ADN lectures en utilisant FLASH (Fast Réglage de la longueur du court Lit) 29 en tapant dans la ligne de commande / path-to-file / flash. Préciser que 16 processeurs devraient être utilisés en utilisant -t 16 et le préfixe de sortie en tapant -o ensilage. </li><li> Identifier TRIMMED lit en tapant silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq path-to-file / flash -t 16 -o FLASHED silage_read2_paired.fastq silage_read1_paired.fastq </li></ol> 12. Classification taxonomique <ol><li> Type / chemin vers un fichier / kraken et spécifiez la base de données en tapant --db / path-to-file / standard. </li><li> Définir que 16 processeurs devraient être utilisés en tapant --threads 16 et identifier un dossier de sortie en utilisant --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Tapez le nom du fichier d&#39;entrée; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq path-to-file / standard --db kraken --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOTE: Classification des échafauds de séquences d&#39;ADN assemblés à l&#39; aide de Kraken 7 a été achevée contre la plus récente base de données, Kraken standard qui contenait toutes les séquences du génome Prokaryote disponibles. </li><li> colonnes de transfert 2 et 3 à partir du fichier de sortie et à un nouveau fichier en tapant cut -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Ouvrez le fichier de sortie dans le navigateur Web. couper -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importez le nouveau fichier dans Krona 12 en tapant ktImportTaxonomy. Spécifiez le fichier d&#39;entrée en tapant FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Identifier le fichier de sortie en tapant -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html. path-to-file / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. Annotation fonctionnelle <ol><li> Accédez au site 47 MG-RAST, http://metagenomics.anl.gov/. Inscrivez-vous comme nouvel utilisateur si nécessaire. Une fois connecté, cliquez sur le bouton &quot;Ajouter&quot;. Téléchargez les échafauds assemblés à partir de l&#39;étape 10. </li><li> Une fois les fichiers téléchargés, cliquez sur «Soumettre» et suivez les instructions et attendre la fin de l&#39;analyse. </li><li> Une fois l&#39;analyse terminée, affichez le lien envoyé via emtous de MG-RAST, ou encore, cliquez sur &quot;Progress&quot;. Il y a une liste des travaux terminés. Cliquez sur l&#39;identifiant de l&#39;emploi correspondante puis sur le lien vers la &quot;page de téléchargement&quot;. </li><li> Sur la page de téléchargement, sous la rubrique «Protein Clustering 90%&quot;, cliquez sur le bouton de protéines pour télécharger le fichier de protéine prédite, 550.cluster.aa90.faa. </li><li> Pour classer les protéines appartenant comme putative à une classe particulière d&#39;enzyme CAZy, comparez les protéines téléchargées dans la base de données CAZy 48. Télécharger la base de données Enzymes Glucides-actifs (CAZy) à partir de fichiers sont: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip et PL.zip. Ces fichiers représentent les classes d&#39;enzymes suivantes respectivement: Activités auxiliaires (liste AA), Glucides Esterases (CE), glycoside hydrolases (GH), glycosyle Transférases (GT) et Polysaccharide lyases (PL). </li><li> Décompressez les fichiers de base de données et d&#39;annoter les protéines en déterminant la similitude des protéines aux protéines de base de données en utilisant le cazy algor USEARCH UBLASTIthm 49. Pour utiliser une boucle de bash (for i in * .txt) pour parcourir la base de données de type 5 fichiers .txt &quot;for i in * .txt; faire». </li><li> Exécutez USEARCH en tapant / path-to-file / usearch8 avec le paramètre -ublast afin d&#39;utiliser l&#39;algorithme de ublast. Ensuite, tapez le nom du fichier de séquence protéique téléchargé à partir de MG-RAST, &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Pour indiquer le fichier de base de données à utiliser le type &quot;-db $ i&quot; et de préciser le seuil E-valeur à 1E -5, tapez &quot;-evalue 1E-5&quot;. </li><li> Mettre fin à la recherche après la découverte d&#39;une séquence cible et classer par conséquent que la séquence de la protéine comme appartenant à la classe cible de l&#39; enzyme, par exemple , la GH, de type &quot;-masaccepts 1&quot;. </li><li> Pour définir que 16 processeurs doivent être utilisés de type &quot;-threads 16&quot; et pour spécifier le format du fichier de sortie comme atab séparés texte de type &quot;-blast6out&quot;. Pour identifier le type de fichier de sortie &quot;$ de i.ublast&quot;. Pour mettre fin à la boucle de bash, type &quot;; fait&quot; for i in * .txt; faire / path-to-file / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out i.ublast $; terminé </li></ol> 14. Visualizing CAZy Annotation <ol><li> Pour visualiser la sortie de l&#39;annotation CAZy comme un diagramme de Venn, générer des listes de protéines d&#39;identité pour chaque classe d&#39;enzyme en utilisant une boucle de bash. Tapez &quot;for i in * .ublast; faire». </li><li> Pour transférer la colonne 1 du fichier de sortie et à un nouveau fichier, tapez &quot;cat $ i | coupé -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Termine la boucle et le type &quot;; done&quot;. </li><li> Ouvrez les fichiers .LIST dans un éditeur de texte. Allez sur le site, sélectionnez le nombre de jeux que 5 et collez le contenu de chaque fichier de liste dans une boîte séparée. Télécharger le diagramme résultant en tant que fichier .SVG. for i in * .ublast; faire cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list; terminé </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Alors qu&#39;une l&#39;analyse silico peut donner un excellent aperçu des communautés microbiennes qui sont présentes dans les échantillons environnementaux, il est essentiel que les classifications taxonomiques ont démontré être effectué en association avec des contrôles appropriés et qu&#39;une profondeur appropriée de séquençage a été réalisé pour capter la totalité population actuelle 51. Avec une analyse de calcul, il y a beaucoup de routes pour atteindre un objectif similaire. Les méthodes que nous avons utilisées dans cette étude sont des exemples de méthodes appropriées et simples, qui ont été réunis pour réaliser une série d&#39;analyses sur le microbiome d&#39;ensilage. Une variété et un nombre toujours croissant d&#39;outils et de techniques bioinformatiques sont disponibles pour analyser les données métagénomique, par exemple Phylosift 8 et MetaPhlAn2 52, et ceux - ci doivent être évalués avant l&#39;enquête de leur pertinence pour l&#39;échantillon et l&#39;analyse required 53. Les méthodes d&#39;analyse metagénomiques sont limitées par les bases de données disponibles pour la classification, la profondeur de mise en séquence et la qualité du séquençage. Le traitement bioinformatique démontré ici a été réalisée sur une machine de haute puissance locale; Cependant les systèmes basés sur le cloud sont également disponibles. Ces services de cloud computing permettent pour la location de la puissance de calcul nécessaire sans avoir l&#39;investissement à coût élevé d&#39;un puissant poste de travail local approprié. Une application potentielle de cette méthode serait d&#39;évaluer l&#39;ensilage avant son utilisation dans l&#39;agriculture pour veiller à ce qu&#39;aucun des bactéries potentiellement nuisibles sont présents donc les empêcher d&#39;entrer dans la chaîne alimentaire.

Métagénomique est l&#39;analyse directe de l&#39; ADN purifié à partir des communautés biologiques trouvés dans les échantillons environnementaux 1 et a été initialement utilisé pour détecter les bactéries non cultivables trouvés dans les sédiments 2. Metagénomique a été largement utilisée depuis un certain nombre d&#39;applications, telles que l&#39; identification du microbiome humain 3, classer les populations microbiennes au sein de l&#39;océan 4 et même pour l&#39;analyse des populations bactériennes qui se développent sur des machines à café 5. L&#39;introduction des technologies de séquençage de prochaine génération a donné lieu à un plus grand débit de séquençage et de sortie. Par conséquent, le séquençage de l&#39; ADN est devenu plus économique 6 et la profondeur de séquençage qui peut être effectuée a considérablement augmenté, ce qui permet la métagénomique de devenir un puissant outil analytique. Améliorations &quot;Front-end&quot; dans l&#39;aspect pratique, moléculaire de séquençage métagénomique ont stimulé la croissance de l&#39;enoutils silico bioinformatiques disponibles pour la classification taxonomique 7-9, annotation fonctionnelle 10,11 et 12,13 représentation visuelle des données de séquence d&#39;ADN. Le nombre croissant de disponibles, séquencée procaryotes et eucaryotes 14 génomes permet encore la précision de la classification des communautés microbiennes, qui sont invariablement réalisées contre une base de données de référence &quot;back-end&quot; de génomes séquencés 15. Deux approches principales peuvent être adoptées pour l&#39;analyse métagénomique. La méthode la plus classique est l&#39;analyse du gène de l&#39;ARNr 16S région du génome bactérien codant. Le ARNr 16S est hautement conservée entre les espèces procaryotes mais présente neuf régions hyper-variable (V1 - V9) qui peut être exploitée pour l&#39; identification des espèces 16. L&#39;introduction de plus le séquençage (≤ 300 pb d&#39;extrémité appariées) a permis l&#39;analyse de séquences d&#39;ADN couvrant deux zones hyper-variables, et en particulierV3 - V4 région 17. Les progrès réalisés dans d&#39; autres technologies de séquençage, telles que Oxford Nanopore 18 et PacBio 19, ne permettent la totalité du gène ARNr 16S à séquencer contigue. Alors que les bibliothèques à base d&#39;ADNr 16S fournissent une approche ciblée pour l&#39;identification des espèces et permettent la détection de l&#39;ADN du faible nombre de copies qui se produit naturellement dans les échantillons purifiés, les bibliothèques de séquençage shotgun permettent la détection d&#39;espèces qui peuvent contenir des régions d&#39;ADN qui sont soit non amplifiable par les 16S ARNr séquences marqueur d&#39;amorces utilisées, ou parce que les différences entre la séquence de matrice et la séquence d&#39; amplification de l&#39; amorce sont trop grands 20,21. En outre, bien que les ADN polymérases ont une haute fidélité de la réplication de l&#39; ADN, des erreurs de base peuvent néanmoins se produire lors de l&#39; amplification PCR et ces erreurs incorporés peuvent aboutir à une classification incorrecte des espèces originaires 22. Biais dans l&#39;amplification par PCR de modèle suivantsuences peuvent également se produire; des séquences d&#39;ADN ayant une teneur élevée en GC peuvent être sous - représentés dans le pool d&#39;amplicon finale 23 et de même des modifications de bases non naturelles, telles que la thymine glycol, peut mettre fin à des ADN polymérases provoquant des défaillances dans l&#39;amplification de séquences d&#39; ADN 24. En revanche, une banque d&#39;ADN de séquençage shotgun est une banque d&#39;ADN qui a été préparé en utilisant tout l&#39;ADN purifié qui a été extrait d&#39;un échantillon et ensuite fragmenté en des longueurs de chaîne d&#39;ADN plus court avant la préparation pour le séquençage. Classification taxonomique des séquences d&#39;ADN générées par séquençage aléatoire est plus précis par rapport à l&#39; ARNr 16S amplicon séquençage 25, bien que le coût financier nécessaire pour atteindre une profondeur de séquençage fiable est supérieure à celle du amplicon séquençage 26. Le principal avantage de séquençage aléatoire métagénomique est que les régions séquencées des différents génomes de l&#39;échantillon sont disponibles pour la prospection génétique une fois qu&#39;ils ont étéa été classé 27 taxonomiquement. les données de séquence métagénomique est analysée par une gamme de plus en plus d&#39;outils bioinformatiques. Ces outils sont en mesure d&#39;effectuer une grande variété d&#39;applications, par exemple, l&#39; analyse de contrôle de la qualité des données de séquences brutes 28, chevauchant la fin appariés lit 29, assemblage de novo de la séquence se lit à contigs et échafauds 30,31, la classification taxonomique et de visualisation la séquence de lecture et des séquences assemblé 7,12,32,33 et l&#39;annotation fonctionnelle des séquences assemblées 34,35. Ensilage, produites par les agriculteurs dans le monde entier à partir de céréales fermentées telles que le maïs (Zea mays), est principalement utilisé comme aliment pour le bétail. Ensilage est traitée avec la bactérie Lactobacillus sp. pour faciliter la fermentation 36 mais à ce jour, il y a une connaissance limitée des autres populations microbiennes trouvées dans l&#39; ensilage. Le fermentsn processus peut conduire à des micro-organismes indésirables et potentiellement dangereux devenant répandue au sein de l&#39;ensilage 37. En plus des levures et moisissures, les bactéries sont particulièrement adaptés à l&#39;environnement anaérobie dans la fermentation de l&#39; ensilage et sont plus fréquemment associés à des maladies du bétail , plutôt que la dégradation de l&#39;ensilage 38. Les bactéries butyriques peuvent être ajoutés , par inadvertance , à partir du sol reste lors du remplissage des silos d&#39;ensilage et sont capables de convertir l&#39;acide lactique, un produit de digestion anaérobie, en acide butyrique, en augmentant ainsi le pH de 39 l&#39;ensilage. Cette augmentation du pH peut conduire à une recrudescence des bactéries d&#39; altération qui serait normalement incapable de soutenir la croissance dans l&#39; ensilage des conditions optimales de fermentation 38. Clostridium spp. , Listeria spp. et Bacillus spp. sont particulièrement préoccupants, en particulier dans l&#39;ensilage pour l&#39;alimentation des bovins laitiers, sous forme de spores bactériennes qui ont survécu à la gastrtractus ointestinal 40 peut entrer dans la chaîne alimentaire, conduire à la détérioration des aliments et, dans de rares cas, à l&#39; animal et des décès humains 37,39,41-44. De plus, alors qu&#39;il est difficile d&#39;estimer l&#39;impact économique exact du traitement vétérinaire et la perte de bétail causée par l&#39;ensilage détérioration, il est susceptible d&#39;être préjudiciable à une ferme si une épidémie devait se produire. On suppose que, en utilisant une approche métagénomique nous pouvons classer les populations microbiennes qui sont présents dans des échantillons d&#39;ensilage et en outre d&#39;identifier les communautés microbiennes associées à l&#39;ensilage détérioration qui, à son tour, ont potentiellement un effet néfaste sur le bétail, ce qui permet des mesures correctives pour être prise avant l&#39;ensilage doit être utilisé en tant que source de nourriture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FastDNA SPIN Kit for Soil</td>
			<td style="width:128px;">MP Bio</td>
			<td style="width:120px;">116560200</td>
			<td style="width:301px;">DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNA FastPrep</td>
			<td style="width:128px;">MP Bio</td>
			<td style="width:120px;">116004500</td>
			<td>DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:128px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:120px;">A63880</td>
			<td>DNA Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elution Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">19806</td>
			<td>DNA Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:120px;">Q33216</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:120px;">Q32854</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nextera XT DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;">FC-131-1024</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;">FC-131-1001</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TapeStation 2200</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">G2964AA</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HS D100 ScreenTape</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5584</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HS D100 ScreenTape Reagents</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5585</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TapeStation Tips</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5153</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TapeStation Tubes</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">401428 and 401425</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High Power Analysis Workstation</td>
			<td style="width:128px;">Various</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>Local or cloud based, user preferred system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Avant le traitement bioinformatique, séquence brute lectures ont été coupé et les adaptateurs ont été enlevés en utilisant le logiciel Trimmomatic 28. Après l&#39;étape de coupe et le filtrage, le nombre de lectures a été ramené à 50% de la séquence se lit comme suit ( voir le tableau 1). Le score moyen de phred de base était&gt; 30 après contrôle de la qualité (Figure 2). Des paires de séquences d&#39; ADN qui avaient des régions qui se chevauchent ont été fusionnées en utilisant le logiciel FLASH 29 pour générer plus simple lit, non-chevauchement lectures ont été conservés dans un fichier séparé. 45,47% lit (105343) combiné avec succès. Après le chevauchement de lit en utilisant FLASH de lit, les fragments étendus résultant ont subi la classification taxonomique des bactéries en utilisant le logiciel Kraken 7 et ont ensuite été visualisés avec le logiciel Krona (Figure 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.dans les pages = &quot;1&quot;&gt; La majorité des espèces bactériennes présentes dans le métagénome de l&#39;ensilage se trouvent à moins de 4 embranchements procaryote: Firmicutes (34%), Actinobactéries (28%), Proteobacteria (27%) et Bacteroidetes (7%) . La répartition des classes présentes dans ces phylums peut être vu sur la figure 4. Les espèces les plus abondantes dans le métagénome étaient Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobactéries), Propionibacterium spp. (3%; Actinobactéries) et Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). Les espèces importantes pour la santé des animaux et impliqués dans la maladie ont également été observées; Clostridium spp. (1%) Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) a été prévu pour être présent dans l&#39;échantillon d&#39;ensilage. Annotation fonctionnelle a été réalisée sur assemblé lit. Le métagénome a été assemblé en utilisant l&#39;assembleur Spades 30 en utilisant la rognée et filtréejumelé-end et apparié lectures générant 92,284 échafauds. Afin d&#39;identifier les cellulases, les protéines ont été estimées à l&#39;aide MG-RAST et annotées en utilisant la base de données Enzymes Glucides-actifs (CAZy). Des protéines prédites 97,562, 6357 ont été annotés comme un hydrate de carbone actif enzyme putative dans l&#39; une des cinq classes d&#39;enzymes qui composent la base de données CAZy (figure 5). Les résultats ont été visualisées sous forme de diagramme de Venn en utilisant le logiciel InteractiVenn 50 montrant la répartition des annotations de protéines , y compris ceux contenant plus d&#39;une CAZy classe enzyme annotation. Parmi ceux-ci, 3861 ont été prédit pour avoir une activité hydrolase glycoside et sera caractérisé en outre en laboratoire pour confirmer la fonction. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Figure 1: Bioinformatic métagénomique Pipeline pour l&#39;analyse de Ensilage. Deux approches principales ont étéutilisé pour étudier le microbiome de l&#39;ensilage, la classification taxonomique et annotation fonctionnelle. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Figure 2: Qualité de séquence par-base avant et après la coupe et de l&#39; adaptateur enlèvement. La séquence graphique de FASTQC par base de qualité montre le score phred moyenne sur toute la longueur de la séquence lit de contrôle avant et après la qualité. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Figure 3: Classifica taxonomiquetion du microbiome bactérien du Ensilage solide. Classification de la séquence garni et le chevauchement se lit de FLASH a été réalisée en utilisant Kraken 7 et ensuite visualisé avec couronne. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Figure 4: Répartition de classe taxonomique du 4 Phyla plus abondant dans le microbiome bactérien du Ensilage solide. Le pourcentage de chaque catégorie de bactéries dans les quatre embranchements le plus abondant. Firmicutes: Clostridia (rouge) et les bacilles (bleu foncé); Proteobacteria: delta / epsilon (rose), alpha (bleu pâle), gamma (orange) et bêta (turquoise); Bacteroidetes: Flavobacteriia (bleu foncé) et Bacteroidia(Vert pâle); Actinobactéries: Coriobacteriia (violet foncé) et d&#39; autres Actinobactéries (vert foncé). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Figure 5: CAZy Annotation du Proteome prédites dans le massif Ensilage microbiome. diagramme de Venn montrant la répartition des cinq classes d&#39;enzymes d&#39;annotations cazy dans le protéome prédit d&#39;ensilage solide microbiome. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw lit </td><td rowspan="2"> # Filtré lit (apparié) </td&gt; <td> # Filtré lit </td><td rowspan="2"> # FLASHED lit </td></tr><tr><td> (Apparié) </td><td> (Apparié) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231679 x2 </td><td> 1892534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Tableau récapitulatif des Séquençage Reads.

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Métagénomique Analyse des Ensilage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

18.0K vues.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Recherche

Génétique

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here is a powerful experimental approach for analyzing the transcription termination defect under physiological conditions. Like the traditional TRO assay, it relies on the presence of a transcriptionally active polymerase beyond the 3&#8242; end of the gene as an indicator of a transcription termination defect1. It overcomes two major problems encountered with the traditional TRO assay. First, it can detect if the polymerase reading through the termination signal is the one that initiated transcription from the promoter-proximal region, or if it is simply representing a pervasively transcribing polymerase that initiated non-specifically from somewhere in the body or the 3&#8242; end of the gene. Secondly, it can distinguish if the transcriptionally active polymerase signal beyond the terminator region is truly the readthrough sense mRNA transcribing polymerase or a terminator-initiated non-coding anti-sense RNA signal. Briefly, the protocol involves permeabilizing the exponentially growing yeast cells, allowing the transcripts that initiated in vivo to elongate in the presence of the BrUTP nucleotide, purifying BrUTP-labelled RNA by the affinity approach, reverse transcribing the purified nascent RNA and amplifying the cDNA using strand-specific primers flanking the promoter and the terminator regions of the gene2.

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

Analyse de terminaison de la transcription Utilisation d&#39;exécution sur la transcription (TRO) Approche BrUTP brin spécifique

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Analyse informatique des données de séquence d’écrans de 2-hybride de levure lot

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...