Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Site Location <ol><li> Sammeln Sie die Silage Probe aus einer geeigneten Stelle wie einer Farm. Hier wurde der Bauernhof in Ballydulea, Co. Cork, Irland (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. DNA-Extraktion HINWEIS: DNA-Extraktion wurde ein kommerzieller Kit folgenden Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Eine negative Kontrolle, die keine Probe enthielt, wurde in der gesamten Bibliothek Herstellungsverfahren verwendet. <ol><li> In 100 bis 400 mg der Probe bis 978 &amp; mgr; l Natriumphosphat-Puffer und 122 ul Boden Lysepuffer in den Lyse Rohre geliefert. </li><li> Homogenisieren Proben durch die Lyse Rohre in den Homogenisator für 40 s bei einer Geschwindigkeit von 6,0 m / s setzen. </li><li> Centrifuge Lysate bei 14000 × g für 15 min und den Überstand auf eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 ul Proteinpräzipitates Solution (PPS). Mischen Sie die Lösung durch Umkehren 10-mal und Zentrifugebei 14000 × g für 5 min. </li><li> Fügen Sie den Überstand in 1 ml DNA-Bindungsmatrix in einem sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Lösung durch das Rohr ständig für 3 min zu invertieren. Lassen Sie die Mischung für 3 Minuten absetzen, verwerfen dann 500 &amp; mgr; l Überstand. Mischen Sie die verbleibende Überstand. </li><li> Übertragung von 600 &amp; mgr; l der Suspension auf einem Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min. Entsorgen Sie das Filtrat und wiederholen Sie den Vorgang mit der verbleibenden Suspension. </li><li> Hinzufügen 500 ul Waschpuffer auf die DNA-Bindungsmatrix innerhalb des Spinfilter, mischen durch Pipettieren, dann Zentrifugieren bei 14.000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Filtrat und Zentrifuge wieder den Spinfilter bei 14.000 × g für 2 min alle Waschpuffer entfernt wird, um sicherzustellen. Trocknen Sie die Spinfilter bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Pre-warm (70 ° C) der DNase-freiem Wasser (DES) und resuspendieren die DNA-Bindungsmatrix in 100 ul DES innerhalb des Spinfilter. Übertragen Sie die Spinfilter auf ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugen tuund Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min DNA zu eluieren. Lagern Sie die gereinigte DNA bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse durchgeführt wird. </li></ol> 3. DNA-Reinigung mit DNA Purification Beads HINWEIS: Vor metagenomic Bibliothek Vorbereitung der extrahierten DNA wurde unter Verwendung von Reinigungsperlen gereinigt, um eine reine DNA-Probe, um sicherzustellen, erhalten. <ol><li> Inkubieren der Perlen bei 23 ° C für 30 min vor dem Gebrauch. Hinzufügen 2 Volumina Kügelchen zu der DNA-Probe und inkubiere die Lösung bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Legen Sie die Proben auf eine Trennung Magnet für 5 min und dann den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 &amp; mgr; l frischem 80% igem Ethanol (EtOH). Luft trocknen die Kügelchen für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Proben aus dem Trennmagneten und 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer (EB), mischen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren der Suspension bei 23 ° C für 5 min, wonach die Proben wieder auf die Trennmagnet für 3 min schalten. </li><li> Transfer den Überstand, der die DNA enthält, in ein sauberes Röhrchen. Entsorgen Sie die Perlen. </li><li> Quantifizieren der gereinigten DNA gemäß Abschnitt vier. </li></ol> 4. Quantifizierung der gereinigten DNA HINWEIS: Die gereinigte DNA wurde quantifiziert den Anweisungen des Herstellers nach einem Fluorometer und doppelsträngige (dsDNA) High Sensitivity (HS) Assay-Kit. <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitslösung unter Verwendung von 199: 1-Verhältnis von Puffer zu Reagenz. </li><li> Fügen Sie 10 ul jeder DNA-Standard bis 190 &amp; mgr; l der Arbeitslösung. </li><li> In 10 ul gereinigter DNA zu 190 &amp; mgr; l der Lösung arbeiten. Das Endvolumen sollte 200 &amp; mgr; l sein. Inkubieren Standard und DNA-Proben bei 23 ° C für 2 min. </li><li> Analysieren Standards, bevor die DNA-Proben auf dem Fluorometer die Anweisungen auf dem Bildschirm verwendet wird. </li></ol> 5. Shotgun Sequencing Bibliothek Vorbereitung HINWEIS: Die Shotgun-Sequenzierung Bibliothek wurde unter Verwendung einerkommerzielle Bibliothek Vorbereitung Kit Anweisungen des Herstellers verwendet wird. <ol><li> Verdünnen Sie die DNA-Proben auf 0,2 ng / &amp; mgr; l unter Verwendung von EB. Alle , die Probe ist bereits unterhalb dieser Konzentration, dh die negative Kontrolle wird an der aktuellen Konzentration gelassen. </li><li> Mix 5 &amp; mgr; l der gereinigten DNA mit 10 &amp; mgr; l Puffer und 5 &amp; mgr; l Enzymgemisch. Inkubieren Proben bei 55 ° C für 5 min. </li><li> In 5 &amp; mgr; l Puffer zu neutralisieren und Inkubation der Lösung bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l von jeder der probenspezifischen Sequenzindizes und 15 &amp; mgr; l PCR-Mastermix. </li><li> In einem Thermocycler, Inkubation der Proben bei 72 ° C für 3 min, 95 ° C für 30 s, vor 12 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s. Inkubieren Proben schließlich bei 72 ° C für 5 min. </li><li> Reinige den vorbereiteten DNA des Wulstes Reinigung wie zuvor, aber mit einer endgültigen Elution von 30 &amp; mgr; l EB verwendet wird. </li></ol> 6. Library Quantität und Qualität prüfen HINWEIS: Die Menge und die Qualität der hergestellten Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Kits und Instrumentierungs beurteilt. <ol><li> Inkubieren Sie die Komponenten des Kits bei 23 ° C für 30 Minuten vor der Verwendung. </li><li> Fügen Sie 2 &amp; mgr; l DNA bis 2 &amp; mgr; l Puffer und vortex für 1 min bei 2000 Upm. </li><li> Drehen um die Probe nach unten zu gewährleisten, ist es an der Unterseite des Rohres ist. </li><li> Setzen Sie die Probenröhrchen, Analyseband und Spitzen in das Gerät, und führen Sie Analyse, wie durch die Software gerichtet. </li></ol> 7. DNA - Sequenzierung <ol><li> Übertragen Sie die vorbereiteten und quantifizierten DNA - Sequenzierung Bibliotheken Proben auf eine Sequenzierdienstleister und Sequenz mit 300 bp gepaart Ende Sequenzierung 45. </li></ol> 8. Analyse von Roh-Sequenzdaten HINWEIS: Die Befehle für jedes Programm ein Linux-Betriebssystem verwenden, werden unter dem Protokollschritt gezeigt. Die Pipeline für s verwendetequence Datenanalyse ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Programme sind vor der Analyse durch den Benutzer installiert werden. Dieser Prozess sollte für jede Probe einzeln durchgeführt werden. <ol><li> Analyse und Visualisierung von Daten DNA - Sequenz FastQC mit 46 eingeben , indem Sie auf der Kommandozeile / path-to-file / fastqc, gefolgt von der Vorwärts- und Rückwärts rohen raw_read1.fastq raw_read2.fastq liest. </li><li> einen Ausgabeordner angeben, indem Sie -o output_fastqc und das Dateiformat der rohen Lese Dateien durch -f fastq eingeben. </li><li> Sehen Sie sich die Ausgabedatei (Abbildung 2). path-to-file / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Qualitätskontrolle Trimming und Filtern von Sequenzdaten <ol><li> Führen Sie das Trimmen Programm, Trimmomatic 28 durch in die Kommandozeile java -jar / path-to-file / trimmomatic-0.35.jar eingeben. </li><li> Geben Sie die Dateien gepaart Ende Dateien durch Eingabe von &quot;PE&quot;. Staat, dass 16 zentrale prHOLZBEARBEITUNGS- Einheiten (CPUs) sollte 16 -threads durch die Eingabe von dem Programm verwendet werden. </li><li> Führen Sie die beiden Dateien in der QC-Überprüfung durch die Namen der rohen vorwärts eingeben und rückwärts liest. Das Präfix der Ausgabedateien wird durch die Eingabe einer -baseout Silage bestimmt. </li><li> Definieren Sie die Optionen für das Programm von ILLUMINACLIP eingeben: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 ERNTE: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36. </li><li> Wenn Sie fertig sind, analysieren die getrimmten Sequenzen unter Verwendung von FastQC wie zuvor, und die Ausgabe auf den Roh-Sequenzdaten zu vergleichen, um sicherzustellen, wurde erfolgreich durchgeführt trimmen. HINWEIS: Das Software-Tool, Trimmomatic, getrimmt liest weiter durch führende niedrige Qualität oder N-Basen zu entfernen (unter Qualität 3), Entfernen von geringer Qualität oder N Basen Hinter (unter Qualität 3) und jede Abtastung mit einem 4-Sockel breite Schiebefenster lesen. Die Parameter wurden eingestellt für das Schneiden, wenn die durchschnittliche Qualität pro Base unter 20 fällt und dann unter 36 Basen jeder liest lange fallen zu lassen. Schließlich wurden 15 Basen abgeschnitten from Kopf jeder lesen und wurden liest abgeschnitten vom Beginn des Lese 200 Basen zu halten. Dieser letzte Schritt wurde durchgeführt, einige Qualitätsprobleme zu überwinden, wenn die Sequenzierung lang (&gt; 200 bp) liest. Diese können für bestimmte Proben 28 eingestellt werden. java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout Silage ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 ERNTE: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36 </li></ol> 10. Metagenom Versammlung <ol><li> das ungepaarte Merge, liest, indem Sie Katze durch das ungepaarte liest gefolgt getrimmt; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Schreiben Sie die Dateien in eine neue Datei, indem Sie&gt; silage_merged_unpaired.fastq Katze silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Um de novo die sequenzierte DNA montieren, verwenden Sie Spades (St. Petersburg Genom Assembler) 30 , indem Sie / path-to-file / spades.py. Gibt an, dass 16 CPUs, indem Sie -t 16 und dass der metagenomic Parameter angewendet sollte, indem Sie --meta verwendet werden sollen. </li><li> Identifizieren Sie die nach vorne getrimmt liest mit -1 silage_read1_paired.fastq und die Rückseite liest von -2 silage_read2_paired.fastq. Das fusionierte ungepaarten liest werden durch -s silage_merged_unpaired.fastq angegeben. </li><li> Definieren Sie den Ausgabeordner von silage_spades eingeben -o. path-to-file / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. Gepaart-End Read Overlap <ol><li> Merge Paare der DNA - Sequenz liest FLASH (schnelle Verstellung des Kurz Liest) unter Verwendung von 29 durch die Eingabe in Kommandozeile / path-to-file / Blitz. Gibt an, dass 16 CPUs sollten über -t 16 und die Ausgabe Präfix, indem Sie -o Silage verwendet werden. </li><li> Identifizieren getrimmten liest von silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq eingeben path-to-file / flash t 16 -o geflasht silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq </li></ol> 12. taxonomische <ol><li> Typ / path-to-file / kraken und die Datenbank angeben, indem Sie --db / path-to-file / Standard. </li><li> Definieren Sie, dass 16 CPUs sollten, indem Sie --threads 16 und identifizieren einen Ausgabeordner unter Verwendung --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt verwendet werden. Geben Sie den Eingabedateinamen; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq path-to-file / kraken --db Standard --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq HINWEIS: Die Einstufung der DNA - Sequenz zusammengesetzt Gerüste mit Kraken 7 gegen die jüngsten, abgeschlossen wurde Standard - Kraken - Datenbank , die alle verfügbaren Prokaryote Genomsequenzen enthalten. </li><li> Transfer Spalten 2 und 3 aus der Ausgabedatei und in eine neue Datei durch die Eingabe einer Schnitt -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Die Ausgabedatei in Web-Browser öffnen. schneiden -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importieren Sie die neue Datei in Krona 12 durch ktImportTaxonomy eingeben. Geben Sie die Eingabedatei durch FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int eingeben. Identifizieren Sie die Ausgabedatei von FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html eingeben -o. path-to-file / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. Funktions Annotation <ol><li> Gehen Sie auf die MG-RAST 47 Website, http://metagenomics.anl.gov/. Registrieren Sie sich als neuer Benutzer, falls erforderlich. in, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Hochladen&quot; Nach der Anmeldung. Laden Sie die zusammengebauten Gerüsten aus Schritt 10. </li><li> Sobald die Dateien hochgeladen haben, klicken Sie auf &quot;Senden&quot; und folgen Sie den Anweisungen und warten auf die Fertigstellung der Analyse. </li><li> Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, sehen Sie den Link per em gesendetail von MG-RAST oder alternativ klicken Sie auf &quot;Progress&quot;. Es gibt eine Liste der abgeschlossenen Aufträge. Klicken Sie auf den entsprechenden Job-ID und dann auf den Link zum &quot;Download-Seite&quot;. </li><li> Auf der Download-Seite unter der Überschrift &quot;Protein Clustering 90%&quot;, klicken Sie auf das Protein, um die vorhergesagten Protein Datei, 550.cluster.aa90.faa zum Download bereit. </li><li> Um die Proteine zu klassifizieren als mutmaßlich Zugehörigkeit zu einer bestimmten cazy Enzymklasse, zu vergleichen , die heruntergeladenen Proteine an die cazy Datenbank 48. Laden Sie die Kohlenhydrat-aktive Enzyme Database (cazy) von Dateien sind: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip und PL.zip. Diese Dateien repräsentieren die folgenden Enzymklassen jeweils: Hilfs Aktivitäten (AA), Carbohydrate Esterasen (CE), Glycosidhydrolasen (GH), Glycosyltransferasen (GT) und Polysaccharidlyasen (PL). </li><li> Entpacken Sie die Datenbankdateien und mit Anmerkungen versehen, die die Proteine ​​durch die Bestimmung der Protein Ähnlichkeit mit den cazy Datenbank Proteine, die die USEARCH UBLAST algor mitithm 49. Um eine Bash-Schleife (for i in * .txt) über die 5-Datenbank TXT-Dateien Typ iterieren &quot;for i in * .txt; do&quot;. </li><li> Führen Sie USEARCH, indem Sie / path-to-file / usearch8 mit dem Parameter -ublast um den ublast Algorithmus zu verwenden. Geben Sie dann den Namen der Datei Proteinsequenz heruntergeladen von MG-RAST &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Um die Datenbankdatei angeben , um Typ verwendet werden &quot;-db $ i&quot; und die E-Wertschwelle bei 1e -5, Typ &quot;-evalue 1e-5&quot; zu spezifizieren. </li><li> Um die Suche nach der Entdeckung einer Zielsequenz zu beenden und damit , dass die Proteinsequenz Klassifizierung als zu der Zielenzymklasse, zB GH, Typ &quot;-masaccepts 1&quot; gesetzt . </li><li> Um festzulegen, dass 16 CPUs sollten Typ verwendet werden &quot;-threads 16&quot; und das Format der Ausgabedatei als ATAB-separierte Texttyp &quot;-blast6out&quot; angeben. Um die Ausgabedateityp &quot;$ i.ublast&quot; identifizieren. Um die Bash-Schleife zu beenden, typ &quot;; getan&quot; für i in * .txt; do / path-to-file / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; erledigt </li></ol> 14. Visualizing cazy Annotation <ol><li> Um die Ausgabe von der cazy Annotation als Venn-Diagramm visualisieren, Protein-ID-Listen für jede Enzymklasse mit einer Bash-Schleife erzeugen. Geben Sie &quot;for i in * .ublast; do&quot;. </li><li> Um Spalte 1 aus der Ausgabedatei übertragen und in eine neue Datei, geben Sie &quot;cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Beenden Sie die Schleife und geben Sie &quot;; done&quot;. </li><li> Öffnen Sie die .list Dateien in einem Texteditor. Gehen Sie auf die Webseite, wählen Sie die Anzahl der Sätze als 5 und fügen Sie den Inhalt der einzelnen Listendatei in einer separaten Box. Laden Sie das resultierende Diagramm als SVG-Datei. für i in * .ublast; tun cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list; erledigt </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Während eine in silico Analyse kann einen hervorragenden Einblick in die mikrobiellen Gemeinschaften geben , die in Umweltproben vorhanden sind, ist es wichtig , dass die taxonomische Klassifikationen zeigte mit entsprechenden Kontrollen und dass eine geeignete Tiefe der Sequenzierung erreicht wurde , in Verbindung durchgeführt werden , um die gesamte zu erfassen Bevölkerung derzeit 51. Mit jeder Computeranalyse, gibt es viele Wege ein ähnliches Ziel zu erreichen. Die Methoden , die wir in dieser Studie verwendet wurden , sind Beispiele für geeignete und einfache Methoden, die zusammengebracht wurden , um eine Reihe von Analysen auf der Silage microbiome zu erzielen. Eine Vielzahl und eine ständig wachsende Zahl von Bioinformatik - Tools und Techniken zur Verfügung metagenomic Daten zu analysieren, zum Beispiel Phylosift 8 und MetaPhlAn2 52, und diese sollten für ihre Relevanz für die Probe und die Analyse req auf die Untersuchung vor ausgewertet werdenuired 53. Metagenomanalyse Methoden werden von den Datenbanken zur Verfügung begrenzt für die Einstufung, Sequenzierung Tiefe und die Qualität der Sequenzierung. Die bioinformatische Verarbeitung hier demonstriert wurde auf lokaler, Hochleistungs-Maschine durchgeführt; jedoch Cloud-basierte Systeme sind ebenfalls erhältlich. Diese Cloud-basierte Dienste ermöglichen die Vermietung der notwendigen Rechenleistung, ohne die hohen Kosten Investition eines geeigneten leistungsfähigen lokalen Arbeitsplatz haben. Eine mögliche Anwendung dieser Methode wäre Silage in der Landwirtschaft vor seiner Verwendung zu beurteilen, daher sicherstellen, dass keine potenziell schädlichen Bakterien vorhanden sind, um sie in die Lebensmittelkette zu verhindern.

Metagenomics ist die direkte Analyse von DNA aus biologischen Gemeinschaften innerhalb Umweltproben 1 gefunden gereinigt und wurde ursprünglich verwendet , kultivierbarer Bakterien in Sedimenten 2 gefunden zu erkennen. Metagenomics wurde für eine Reihe von Anwendungen, beispielsweise die Identifizierung der humanen microbiome 3, Klassifizieren mikrobiellen Populationen im Meer 4 und auch für die Analyse der Bakteriengemeinschaften, entwickeln sich auf Kaffeemaschinen 5 eingesetzt. Die Einführung der nächsten Generation-Sequencing-Technologien führte zu größeren Sequenzierungsdurchsatz und Ausgang. Folglich wurde DNA Sequenzierung wirtschaftlichere 6 und die Tiefe der Sequenzierung werden , die stark erhöhte durchgeführt hat werden kann, Metagenomics werden ein leistungsfähiges, analytisches Werkzeug ermöglicht. &quot;Front-end&quot; Verbesserungen in der praktischen, molecular Aspekt metagenomic Sequenzierung haben , das Wachstum der in getriebensilico Bioinformatik - Tools zur Verfügung für die taxonomische Klassifizierung 7-9, funktionelle Annotation 10,11 und visuelle Darstellung 12,13 von DNA - Sequenzdaten. Die zunehmende Zahl der zur Verfügung stehenden, sequenziert pro- und eukaryotischen Genomen 14 ermöglicht eine weitere Genauigkeit bei der Klassifizierung von mikrobiellen Gemeinschaften, die gegen ausnahmslos durchgeführt werden , ein &quot;Back-End&quot; Referenzdatenbank von sequenzierten Genome 15. Zwei Hauptansätze für Metagenom-Analyse übernommen werden. Die herkömmlicheren Verfahren ist die Analyse der 16S rRNA-Gen codierende Region der bakteriellen Genoms. Die 16S - rRNA ist stark zwischen Prokaryonten Spezies konserviert , aber weist neun hypervariablen Regionen (V1 - V9) , die zur Spezies Identifizierung 16 ausgenutzt werden kann. Die Einführung von mehr Sequenzierung (≤ 300 bp paarigen end) für die Analyse von DNA-Sequenzen erlaubt Spanning zwei hypervariablen Regionen, insbesonderedie V3 - V4 Bereich 17. Advances in anderen Sequenzierungstechnologien, wie Oxford Nanopore 18 und PacBio 19, erlauben die gesamte 16S - rRNA - Gen angrenzend sequenziert werden. Während 16S rDNA basierte Bibliotheken einen gezielten Ansatz zur Identifizierung von Arten liefern und den Nachweis von geringer Kopienzahl DNA ermöglichen, die in gereinigten Proben, Shotgun-Sequenzierung Bibliotheken ermöglichen die Detektion von Spezies natürlicherweise vorkommt, die DNA-Bereiche enthalten, die entweder nicht amplifizierbare durch die 16S sind rRNA Marker Primersequenzen verwendet werden, oder weil die Unterschiede zwischen der Template - Sequenz und die Verstärkungsprimersequenz sind zu groß , 20,21. Obwohl weiterhin DNA - Polymerasen eine hohe Genauigkeit der DNA - Replikation, können Basisfehler dennoch während des PCR - Amplifikation auftreten und auf diese eingebauten Fehler in falsche Klassifizierung der ursprünglichen Spezies 22 führen kann. Vorspannungen in der PCR-Amplifikation des Templates seqüsse kann auch auftreten; Sequenzen von DNA mit einem hohen GC - Gehalt kann unter im endgültigen Amplikon Pool 23 und ähnlich unnatürliche Basenmodifikationen, wie Thymin Glykol dargestellt werden, können DNA - Polymerasen , wodurch Fehler in der Amplifikation von DNA - Sequenzen 24 stoppen. Im Gegensatz dazu ist eine Shotgun-Sequenzierung DNA-Bibliothek eine DNA-Bibliothek, die unter Verwendung aller der gereinigten DNA hergestellt worden ist, die aus einer Probe und anschließend fragmentiert in kürzere DNA-Kettenlängen vor der Herstellung für die Sequenzierung extrahiert wurde. Taxonomische Klassifizierung von DNA - Sequenzen , die durch Shotgun - Sequenzierung erzeugt wird genauer , wenn im Vergleich zu 16S - rRNA - Amplikon - Sequenzierung 25, obwohl der finanzielle Aufwand eine zuverlässige Sequenzierungstiefe zu erreichen ist erforderlich größer als die der Amplikon - Sequenzierung 26. Der große Vorteil der Shotgun-Sequenzierung Metagenom ist, dass sequenzierten Regionen der verschiedenen Genomen in der Probe für die Gen-Prospektion zur Verfügung stehen, sobald sie gewesen seinwurde 27 taxonomisch klassifiziert. Metagenom-Sequenzdaten werden von einer ständig wachsenden Palette bioinformatischer Tools analysiert. Diese Werkzeuge sind in der Lage eine Vielzahl von Anwendungen auszuführen, zum Beispiel Qualitätskontrolle Analyse der Roh - Sequenzdaten 28, der gekoppelten Ende überlappende liest 29, de novo Assemblierung von Sequenz liest zu Contigs und Gerüsten 30,31, taxonomische Klassifizierung und Visualisierung der Sequenz liest und montierten Sequenzen 7,12,32,33 und die funktionelle Annotation von montierten Sequenzen 34,35. Silage, von den Landwirten auf der ganzen Welt aus fermentiertem Getreide hergestellt wie Mais (Zea Mays) wird überwiegend als Viehfutter verwendet. Silage wird mit dem Bakterium Lactobacillus sp behandelt. zu unterstützen 36 Gärung bis heute, aber es gibt begrenzte Kenntnis der anderen in Silage gefunden mikrobiellen Populationen. Die fermentation Prozess kann zu unerwünschten und potenziell schädlichen Mikroorganismen führen , dass weit verbreitet in der Silage 37. Neben Hefen und Schimmelpilze, Bakterien sind besonders anpassungsfähig an die anaerobe Umgebung in Silagen Fermentieren und häufiger im Zusammenhang mit Erkrankungen bei Nutztieren sind statt der Abbau der Silage 38. Buttersäurebakterien können versehentlich aus dem Boden zugesetzt werden , bleibt , wenn die Silage Silos Füllen und sind in der Lage , die Milchsäure, ein Produkt von anaerober Digestion, um Buttersäure zu konvertieren, wodurch der pH - Wert der Silage Erhöhung 39. Dieser Anstieg des pH - Wertes kann in Fäulnisbakterien zu einem Aufschwung führen , die normalerweise nicht in der Lage sein würde , 38 Wachstum unter optimalen Silagefermentationsbedingungen aufrecht zu erhalten. Clostridium spp. , Listeria spp. und Bacillus spp. sind von besonderer Bedeutung, vor allem in Silage für Milchvieh Futtermittel, wie Bakteriensporen, die die gastr überlebt habenointestinal - Darm - Trakt 40 können die Nahrungskette gelangen, führen zu Verderb von Lebensmitteln und in seltenen Fällen von Mensch und Tier Todesfälle 37,39,41-44. Hinzu kommt, dass es schwierig ist, die genaue wirtschaftlichen Auswirkungen der tierärztlichen Behandlung und Vieh Verlust von Silage Verderb verursacht abschätzen zu können, ist es wahrscheinlich zu einer Farm schädlich sein, wenn ein Ausbruch stattfinden war. Es wird vermutet, dass durch eine Metagenom-Ansatz können wir die mikrobiellen Populationen zu klassifizieren, die in Silageproben vorhanden sind und weiterhin mikrobielle Gemeinschaften mit Silage Verderb verbunden sind, identifizieren, die wiederum würde möglicherweise eine schädliche Wirkung auf das Vieh haben, so dass Abhilfemaßnahmen zu vor der Silage genommen ist als Nahrungsquelle verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FastDNA SPIN Kit for Soil</td>
			<td style="width:128px;">MP Bio</td>
			<td style="width:120px;">116560200</td>
			<td style="width:301px;">DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNA FastPrep</td>
			<td style="width:128px;">MP Bio</td>
			<td style="width:120px;">116004500</td>
			<td>DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:128px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:120px;">A63880</td>
			<td>DNA Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Elution Buffer</td>
			<td style="width:128px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">19806</td>
			<td>DNA Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:120px;">Q33216</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:120px;">Q32854</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nextera XT DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;">FC-131-1024</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;">FC-131-1001</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TapeStation 2200</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">G2964AA</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HS D100 ScreenTape</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5584</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HS D100 ScreenTape Reagents</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5585</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TapeStation Tips</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">5067-5153</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TapeStation Tubes</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:120px;">401428 and 401425</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:128px;">Illumina</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High Power Analysis Workstation</td>
			<td style="width:128px;">Various</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>Local or cloud based, user preferred system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Vor der bioinformatischen Verarbeitung, liest wurden Rohsequenz getrimmt und Adapter wurden mit Trimmomatic Software 28 entfernt. Nach dem Trimmen und Filterungsschritt liest die Anzahl von bis zu 50% der Sequenz reduziert liest (Tabelle 1). Die durchschnittliche Basis phred Stand&gt; 30 nach Qualitätskontrolle (Abbildung 2). Paare von DNA - Sequenzen , die wurden überlappende Bereiche hatten 29 FLASH Software verschmolzen mit zu erzeugen einzelne länger liest, nicht überlappende liest in einer separaten Datei gespeichert. 45.47% liest (105.343) erfolgreich kombiniert. Im Anschluss an die Überlagerung von liest FLASH mit der liest, sind die resultierenden Fragmente erweitert bakterielle taxonomische Klassifizierung mit Kraken - Software 7 und wurden anschließend visualisiert mit Krona Software (Abbildung 3) unterzogen wurden . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Die Mehrheit der Bakterienarten, die in der Silage Metagenom sind innerhalb von 4 prokaryotischen phyla gefunden: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), Proteo (27%) und Bacteroidetes (7%) . Die Verteilung der Klassen , die innerhalb dieser Stämme können in Abbildung 4 zu sehen ist. Die häufigsten Arten in der Metagenom waren Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) und Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). Arten wichtig für die Tiergesundheit und in Krankheit in Verbindung gebracht wurden ebenfalls beobachtet; Clostridium spp. (1%) , Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) vorhergesagt wurden, die in der Silage Probe sein. Functional Annotation wurde am durchgeführt montiert liest. Die Metagenom wurde mit der Pik montiert Assembler 30 der zugeschnittene und filtriertPaired-End und ungepaarten liest Erzeugung 92.284 Gerüste. Um Cellulasen zu identifizieren, wurden die Proteine ​​vorhergesagt MG-RAST mit und kommentierte die Kohlenhydrat-aktive Enzyme Datenbank unter Verwendung von (cazy). Von den 97.562 vorhergesagten Proteine wurden 6357 als mutmaßliche Kohlenhydrat-aktives Enzym kommentierte in einer der fünf Enzyme Klassen, die die cazy Datenbank (Abbildung 5) bilden. Die Ergebnisse wurden als ein Venn - Diagramm unter Verwendung von 50 InteractiVenn visualisiert Software die Verteilung von Protein Annotationen einschließlich derjenigen zeigt , die mehr als eine Cazy Enzymklasse Annotation. Davon wurden 3861 vorhergesagt Glycosid-Hydrolase-Aktivität aufweisen und im Labor weiter charakterisiert werden Funktion zu bestätigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die bioinformatische Metagenomics Pipeline für die Analyse von Silage. Zwei Hauptansätze warenverwendet, um die microbiome von Silage, taxonomische Klassifizierung und funktionelle Annotation zu untersuchen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Abbildung 2: Sequenz Qualität Per-Basis vor und nach dem Trimmen und Adapter Entfernen. Die pro-Basensequenz Qualität Plot von FASTQC zeigt die durchschnittliche phred Punktzahl über die Länge der Sequenz liest vor und nach der Qualitätskontrolle. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die taxonomische Classification des bakteriellen Microbiome Solid Silage. Klassifizierung von getrimmt und überlappende Sequenz liest aus FLASH durchgeführt wurde Kraken 7 verwenden und anschließend mit Krone sichtbar gemacht . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Abbildung 4: Taxonomische Klassenverteilung des 4 am reichlichsten Phyla in der Bakterien Microbiome Solid Silage. Der Anteil der einzelnen Klassen von Bakterien innerhalb der vier am häufigsten vorkommende Stämme. Firmicutes: Clostridien (rot) und Bazillen (dunkelblau); Proteo: delta / epsilon (rosa), alpha (blassblau), Gamma (orange) und Beta (türkis); Bacteroidetes: Flavobacteriia (dunkelblau) und Bacteroidia(blasses Grün); Actinobacteria: Coriobacteriia (dunkelviolett) und andere Actinobacteria (dunkelgrün). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Abbildung 5: cazy Annotation des Prognostizierte Proteome im festen Silage Microbiome. Venn-Diagramm der Verteilung der fünf Enzymklassen Cazy Annotationen in der vorhergesagten Proteoms von festen Silage microbiome zeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw liest </td><td rowspan="2"> # Filtered liest (gepaart) </td&gt; <td> # Filtered liest </td><td rowspan="2"> # Geflasht liest </td></tr><tr><td> (Gepaart) </td><td> (Ungepaarten) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1892534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung Tabelle der Sequenzierung liest.

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomanalyse von Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

18.0K Aufrufe.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Serie: Metagenomic Analysis of Silage

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Forschung

Genetik

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here is a powerful experimental approach for analyzing the transcription termination defect under physiological conditions. Like the traditional TRO assay, it relies on the presence of a transcriptionally active polymerase beyond the 3&#8242; end of the gene as an indicator of a transcription termination defect1. It overcomes two major problems encountered with the traditional TRO assay. First, it can detect if the polymerase reading through the termination signal is the one that initiated transcription from the promoter-proximal region, or if it is simply representing a pervasively transcribing polymerase that initiated non-specifically from somewhere in the body or the 3&#8242; end of the gene. Secondly, it can distinguish if the transcriptionally active polymerase signal beyond the terminator region is truly the readthrough sense mRNA transcribing polymerase or a terminator-initiated non-coding anti-sense RNA signal. Briefly, the protocol involves permeabilizing the exponentially growing yeast cells, allowing the transcripts that initiated in vivo to elongate in the presence of the BrUTP nucleotide, purifying BrUTP-labelled RNA by the affinity approach, reverse transcribing the purified nascent RNA and amplifying the cDNA using strand-specific primers flanking the promoter and the terminator regions of the gene2.

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...