Los autores agradecen al personal de la instalación de animales (BRC) por su apoyo continuo. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Salud y de Investigación Médica y el Consejo Australiano de Investigación.

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de Ética y Cuidado de Animales de la Universidad de Nueva Gales del Sur. 1. Preparación del transgén (integración aleatoria) <ol><li> Electroforesis analítica en gel de agarosa. <ol><li> Digerir el plásmido para extirpar el transgén utilizando enzimas apropiadas (1 h de incubación) o enzimas de digestión rápida (15 a 30 min de incubación) en un termociclador siguiendo las recomendaciones del fabricante (ver Figura 2A y su leyenda). </li><li> Se echó un gel de agarosa de ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético al 1% (TEA), teñido con 0,5-1,0 μg / ml de bromuro de etidio (EtBr). NOTA: Tenga cuidado cuando utilice EtBr; Es un potente mutágeno. Utilice el equipo de protección personal adecuado (consulte la hoja de datos de seguridad del material). </li><li> Cargar un marcador de peso molecular de 1 kb. </li><li> Cargar los fragmentos linealizados ( es decir, transgén y columna vertebral). </lI&gt; <li> Ejecutar la electroforesis a 100 V durante 45 min. </li><li> Visualizar el gel en un transiluminador ultravioleta (UV) para comprobar que la digestión es completa y confirmar el tamaño correcto del transgén ( es decir, 7,338 pb; véase la figura 2A ). </li></ol></li><li> Electroforesis preparativa en gel de agarosa. <ol><li> Se echó un gel de agarosa TAE al 1% teñido con una tinción de gel de baja toxicidad. Cargar 8 alícuotas (1 μg cada una) de transgén linealizado sin un marcador de peso molecular y ejecutar la electroforesis a 100 V durante 45 min. Utilice un bisturí para excisar todas las 8 bandas correspondientes al transgén linealizado. </li><li> Extraer el ADN usando un kit de extracción de gel siguiendo las recomendaciones del fabricante (ver Tabla de Materiales ). <ol><li> Se funden los fragmentos de gel a 50 ° C en tubos de 1,5 ml durante al menos 15 min. Se precipita con isopropanol y luego se añade el tampón de unión. </li><li> Combine todo el DNA pipeteando todo en una columna. Eluir en tampón de microinyección libre de nuclease (Tris-HCl 8 mM y EDTA 0,15 mM). Filtrar a través de un filtro de microcentrífuga de 0,22 μm y centrifugar durante 60 s a 12.000 x g. </li></ol></li><li> Medir la concentración y la calidad del ADN utilizando un espectrofotómetro. Compruebe que la relación A260 / A280 es de alrededor de 1,8 ( es decir, no hay contaminación por proteínas) y la relación A260 / A230 es de al menos 2,0 ( es decir, no hay contaminación por disolventes orgánicos). Diluir hasta 3 ng / μL en tampón de microinyección sin nucleasa, alícuota (20-50 μL) y congelar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Síntesis de los componentes CRISPR (Gene Targeting) <ol><li> ARNm de Cas9. <ol><li> Diluir el ARNm de Cas9 (obtenido de una fuente comercial, véase la Tabla de Materiales ) a una concentración de 1 μg / μl en tampón de microinyección libre de nucleasa. </li><li> Alícuota en 2 μL y libre<html> Ze a -80ºC. </li></ol></li><li> Single-guide RNA (SgRNA). <ol><li> Identificar las dos secuencias genómicas deseadas (guías) utilizando una herramienta de diseño computacional que permite un mínimo potencial fuera de la actividad objetivo [ 17] . <ol><li> Para el knockout de genes, seleccionar sistemáticamente dos guías situadas a unos pocos cientos de pares de bases (bp), en direcciones opuestas, e incluir el codón de inicio del gen de interés. Para la reparación directa de homología, seleccione dos guías superpuestas (siempre que sea posible), en direcciones opuestas. NOTA: A modo de ejemplo, las guías siguientes han sido recientemente co-inyectadas con éxito para interrumpir el primer exón del gen TPM4.2 : Guía 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Guía 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Ordenar un conjunto de cebadores como se describe en la Tabla 1 . </li><li> Sintetiza una plantilla de ADN lineal. <ol><li> Diluir px330Ref &quot;&gt; 12 a 10 ng / μl en agua libre de nucleasa. </li><li> Prepare la mezcla maestra como se indica en la Tabla 1 . Añadir la polimerasa al final y mantener la mezcla principal en hielo. </li><li> Mezclar y dividir en 8 tubos de PCR (19 μl / tubo). Añadir 1 μl de px330 por tubo y ejecutar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 min a 98 ° C; 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 15 s; Y un alargamiento final a 72 ° C durante 5 min. Mantener a 4 ° C. </li><li> Purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR (véase la Tabla de Materiales ), un colector y una fuente de vacío (para un procesamiento más rápido). Aplicar la máxima resistencia al vacío ( es decir, 8 mbar). <ol><li> Añadir 5 volúmenes (100 μl) de tampón de unión a 1 volumen de la muestra de PCR y mezclar. </li><li> Coloque una columna de centrifugado de membrana de sílice (proporcionada) en un tubo de recolección (provisto) de 2 ml para centrifugación o en el colector para el proceso de vacíoEn g. Para unir ADN, aplique sucesivamente las 8 muestras a la columna y vacíe o centrifugue durante 60 s a 12.000 xg para cada carga. </li><li> Para lavar, añadir 0,75 ml de tampón de lavado (tampón PE) a la columna y vacío o centrifugar durante 60 s a 12.000 x g. Centrifugar la columna durante 60 s a 12.000 xg para eliminar el etanol residual. </li><li> Coloque la columna en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Para eluir el ADN, añadir 30 μL de agua libre de nucleasa al centro de la membrana, dejar reposar la columna durante 1 min y centrifugar durante 60 s a 12.000 g. </li></ol></li><li> Medir la concentración utilizando un espectrofotómetro; Típicamente, la concentración debe ser de 100 ng / μl o superior. Compruebe que la relación A260 / A280 es de alrededor de 1,8 ( es decir, no hay contaminación por proteínas) y la relación A260 / A230 es de al menos 2,0 ( es decir, no hay contaminación por disolventes orgánicos). </li></ol></li><li> Transcripción in vitro usando un kit de síntesis de ARN T7. <ol><li> PrepararMezcla principal, como se indica en la Tabla 1 , e incubar durante 3 ha 37 ° C en un termociclador. Añadir 28 μl de agua libre de nucleasa y 2 μl de DNasa I e incubar durante otros 15 minutos a 37 ° C en un termociclador. </li></ol></li><li> Purificación de ARN utilizando columnas giratorias. <ol><li> Disolver el polvo contenido en la columna de centrifugado proporcionada en 650 μl de tampón de microinyección libre de nucleasas, eliminando cuidadosamente todas las burbujas de aire. Tape el tubo e hidrate durante 5 - 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire la tapa azul en la parte inferior y coloque la columna en un tubo de 2 ml. Centrifugar durante 2 min a 750 xg y temperatura ambiente. Coloque la columna en un tubo fresco de 1,5 ml y aplique 50 μL de la solución de ARN gota a gota al centro, sin tocar la pared de la columna. Girar la columna durante 2 min a 750 x g. </li><li> Mida la concentración de ARN usando un espectrofotómetro (el rendimiento típico de una reacción es de 30 - 50 μg). Compruebe que la relación A260 / A280 esAlrededor de 2,0 ( es decir, sin contaminación por proteínas) y la relación A260 / A230 es de al menos 2,0 ( es decir, no hay contaminación por disolventes orgánicos). Guarde los sgRNAs a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Evaluar la calidad del ARN usando los geles TAE al 1% utilizados habitualmente para la electroforesis de ADN. Ejecutar 200-400 ng de la plantilla de ADN y el correspondiente sgRNA en paralelo. La banda de ARN (≈ 100 pb) debería ser ligeramente mayor que la banda de ADN (véase la Figura 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Plantilla de donante <ol><li> Solicitar oligonucleótidos monocatenarios sintetizados comercialmente (ssOligos, véase la Tabla de Materiales ) para mutaciones puntuales o para la integración de pequeñas secuencias de hasta 50 pb; Homología armas son típicamente 60-90 pb de largo. </li><li> Para inserciones más grandes, use un plásmido donante como plantilla. Generar un plásmido adecuado usando el método de clonación clásico o la síntesis de novo de unFuente comercial. NOTA: Se recomienda un mínimo de 800 pb por homología. El tamaño de la columna vertebral no tiene influencia sobre la eficiencia de la homología directa de reparación (HDR). </li></ol> 4. Mezcla de inyección <ol><li> Diluir el ARNm de Cas9 a 50 ng / μl y los sgRNAs a 12,5 ng / μl (25 ng / μL en total) utilizando tampón de microinyección libre de nucleasa para experimentos de knockout génico. Añadir la plantilla de donante (ssOligo o plásmido) a una concentración de 200 ng / μ l para el genoma de edición de experimentos basados ​​en homología reparación directa. NOTA: Los volúmenes de dilución se pueden determinar fácilmente utilizando herramientas en línea, como una calculadora de resuspensión 18 . </li><li> Mantenga cada alícuota en hielo durante la sesión de microinyección y deséchela después (no vuelva a congelar la mezcla de inyección). </li></ol> 5. Vasectomía escrotal NOTA: Dos tipos de vasectomía se realizan comúnmente en ratones: abdominal y escrotal. El últimoEs menos invasiva y se ha descrito previamente [ 15] . <ol><li> Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable. </li><li> Determinar el peso del ratón usando una escala de pesada y anestesiar a los machos por inyección intraperitoneal (ip) con anestésicos inyectables (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitoree la pérdida del reflejo del pellizco del dedo del pie y una vez que el ratón está sedado colóquelo encima de un cojín de calefacción. </li><li> Desinfectar la piel alrededor de los testículos con toallitas alternas de un antiséptico tópico como la clorhexidina y etanol al 70%. </li><li> Empuje los testículos hacia el saco escrotal y haga una incisión en la piel con un bisturí. </li><li> Visualice el testículo, la cauda del epidídimo y el conducto deferente. </li><li> Coge el conducto deferente con fórceps, sosténgalo y cauterize en cada lado de la pinza para retirar 3 mm del conducto deferente. </li><li> Realizar el mismo procedimiento en el segundo testículo. </li><li> Cierre las incisiones de la piel con clips de herida yRatón de cerca hasta la recuperación completa. </li></ol> 6. Superovulación (donantes de ovocitos) y el tiempo de apareamiento (hembras pseudo-embarazadas) NOTA: La técnica para generar un número adecuado de ovocitos fecundados y hembras foster taponadas para reimplantación se ha descrito en otra parte 15 . <ol><li> Inyectar 10 mujeres ip con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG, en 100 μl) a las 12:00 del día 1. </li><li> Inyectar las hembras ip con 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG, en 100 μl) 46-48 h después (alrededor de las 11 am del día 3). </li><li> Acoplar inmediatamente a las hembras con machos de una sola vivienda durante la noche. </li></ol> 7. Inyecciones pronucleares (de integración aleatoria) y citoplásmicas (de orientación génica) <ol><li> Cull los ratones superovulados por dislocación cervical, exponer el abdomen, y el acceso a los ovarios y oviductos, como se describe anteriormente [ 15] . Diseccionar el oViducts y cosechar los complejos cumulus-ovocito (COCs) bajo un stereomicorscope [ 15] . Colóquelas en una gota de potasio simple optimización medio suplementado con aminoácidos (KSOMaa) siguiendo el método tradicional 15 . </li><li> Purificar los ovocitos añadiendo aproximadamente 1 μl de hialuronidasa (10 mg / ml) a la gota de medio KSOMaa utilizando una pieza bucal del aspirador y colocar la cápsula en una incubadora a 37ºC / CO2 al 5% durante 30 s a 1 min. </li><li> Lavar los ovocitos con 4 gotas nuevas de medio KSOMaa utilizando la pieza bucal del aspirador y transferirlos a una gota final de medio KSOMaa recubierto con aceite mineral (alrededor de 2 ml). Colocar el plato en la incubadora de 37 ° C / CO 2 al 5% hasta que los ovocitos estén listos para la inyección. </li><li> Inyección pronuclear (integración aleatoria). <ol><li> Visualizar los huevos bajo el microscopio estereoscópico y transferir aproximadamente 50 huevos a la cámara de inyecciónP de medio M2 recubierto con aceite mineral) usando la pieza bucal del aspirador. </li><li> Transferir la cámara de inyección al microscopio invertido e inyectar los ovocitos fecundados (dos pronúcleos visibles) con unos picolitros de la mezcla de inyección, apuntando a un pronúcleo (cualquiera de los pronúcleos puede ser objetivo). Visualizar una inyección exitosa observando la hinchazón del pronúcleo. </li></ol></li><li> Inyección citoplasmática (orientación génica). <ol><li> Transferir aproximadamente 50 huevos a una gota de KSOMaa que contiene 5 μg / ml de citocalasina B usando la pieza bucal e incubar durante 5 min en la incubadora a 37ºC / CO 2 al 5%. </li><li> Transferir los huevos a la cámara de inyección con la pieza bucal. </li><li> Inyectar pocos picolitros de la mezcla de inyección en el citoplasma a una presión muy baja (50-100 hPa), utilizando la presión de compensación del microinyector automático cuando sea posible. </li><li> Después de la inyección, transfiera los ovocitos de nuevo a una gota de KSOMaa (con la boca) y mantenerlos en el incubador de 37 ° C / 5% CO 2 , hasta que se cargan para su reimplantación en el oviducto de las hembras pseudo-preñadas. </li></ol></li></ol> 8. Reimplantación <ol><li> Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable. </li><li> Determinar el peso del ratón utilizando la escala de pesada y anestesiar a las hembras por inyección intraperitoneal (ip) con anestésicos inyectables (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitoree la pérdida del reflejo del pellizco del dedo del pie y una vez que el ratón está sedado colóquelo encima de un cojín de calefacción. </li><li> Clip de una gran área de la piel alrededor de la línea media dorsal de la hembra del ratón. </li><li> Desinfectar la piel expuesta con toallitas alternas de un antiséptico tópico como la clorhexidina y etanol al 70%. </li><li> Exponer el tracto reproductivo siguiendo el método tradicional 15 . Haga una incisión de la piel de 1 cm de longitud paralela a la línea media dorsal, corte el músculo y agarre la almohadilla de grasa wiCon una pinza, luego tire suavemente del ovario hasta que su oviducto y el útero estén claramente visibles. </li><li> Fijar la almohadilla de grasa con una abrazadera del recipiente. Visualice el oviducto bajo el microscopio estereoscópico y usando un par de micro-tijeras hacer una incisión en la pared del oviducto pocos milímetros aguas arriba de la ampolla. </li><li> Bajo el microscopio estereoscópico, cargue 25 huevos microinyectados en el capilar de vidrio conectado a la pieza bucal (el diámetro interno del capilar debe ser alrededor de 120 μm de ancho). Introducir el capilar de vidrio en el oviducto y expulsar hasta que una burbuja de aire sea visible dentro de la ampolla. </li><li> Retire suavemente el capilar de vidrio y coloque el tracto reproductivo en el abdomen. Suturar la incisión con suturas quirúrgicas no absorbibles 3-0, luego cerrar con clips de herida. Monitoree el ratón de cerca hasta la recuperación completa. </li></ol> 9. Estrategias de genotipificación / secuenciación NOTA: Aislar el genomaADN de biopsias de 2 mm de la cola o del oído, siguiendo las normas de ética animal pertinentes. <ol><li> Extracción rápida de ADN genómico (integración aleatoria). <ol><li> Lyse las muestras de tejido (~ 2 mm) a 95 ° C durante 1 h en 100 μ l de reactivo de lisis alcalina (25 mM hidróxido de sodio y 0,2 mM EDTA, pH = 12). </li><li> Añadir 100 μl de reactivo neutralizante (Tris-HCl 40 mM, pH = 5). </li><li> Centrifugar durante 5 min a 12.000 gy 4 ° C. </li></ol></li><li> Extracción de ADN genómico de alta calidad (orientación génica). <ol><li> Se añaden 500 μl de tampón cola (Tris 50 mM, pH = 8, EDTA 100 mM, pH = 8, NaCl 100 mM, SDS al 1% y proteinasa K 0,5 mg / ml). </li><li> Incubar durante la noche a 55 ° C. </li><li> Mezclar durante 5 minutos por inversión (no vórtice). </li><li> Añadir 250 μL de NaCl saturado (6 M) y mezclar durante 5 min por inversión (no agitar vórtice). </li><li> Hacer girar durante 5-10 minutos a 12.000 xg y 4 ° C y verter el sobrenadante en el tubo nuevo. </lI&gt; <li> Añadir 500 μl de isopropanol y mezclar durante 5 min por inversión (no vórtice). </li><li> Girar durante 10 min a 12.000 xg y temperatura ambiente. </li><li> Decantar el sobrenadante (el pellet es invisible y se pega al tubo). </li><li> Lavar con 1 ml de etanol al 70%. </li><li> Girar durante 5-10 min a 12.000 xg y temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con cuidado, ya que el pellet blanco ya no es pegajoso y se puede perder. </li><li> Secar al aire durante ~ 1 h. </li><li> Añadir 400 μl de tampón TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM, pH = 8). </li><li> Disolver el ADN a 55-60 ° C durante 2 h. </li></ol></li><li> Diseño del cebador. <ol><li> Diseño de los cebadores un mínimo de 20 pb de largo utilizando una herramienta computacional 19 . NOTA: Para la integración aleatoria, los cebadores deben hibridarse con el transgén, generando un fragmento distinto de 200-800 pb. Para la orientación génica, diseñar los cebadores para que se hibridan con el ADN genómico, la generación de un distinto fRación de unos cientos de pb alrededor de los sitios de corte. Para inserciones grandes, los cebadores pueden sentarse sobre el transgén, pero la confirmación de la integración dirigida se debe realizar posteriormente usando el caminar de imprimación o una técnica similar. </li></ol></li><li> PCR genotipificación. <ol><li> Para cada modificación genómica, diseñar un nuevo protocolo de PCR y probarlo empíricamente. Consideremos la longitud del fragmento generado y la temperatura de fusión (Tm) de cada par de cebadores. </li></ol></li><li> Secuenciación. <ol><li> Para la orientación de genes, envíe productos de PCR a un proveedor de servicios de secuenciación de Sanger. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li>
<li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li>
<li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarantz+Henig%2C+R+%22The+Monk+in+the+Garden%22">The Monk in the Garden</a>. , Mariner books. (2000).</li>
<li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li>
<li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li>
<li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li>
<li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li>
<li>Ittner, L. M., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>CRISPR DESIGN. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://crispr.mit.edu">http://crispr.mit.edu</a> (2017).</li>
<li>Integrated DNA Technologies. Resuspension Calculator. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017).</li>
<li>BioTools at UMass Medical School. Primer3: WWW primer tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi">http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</a> (2017).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li>
<li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency%2C+aneuploidy+rates%2C+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49(2012).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout%2C+single-amino-acid-substituted%2C+and+floxed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88(2001).</li>
<li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431(2016).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+via+CRISPR%2FCas9+mediated+homology-independent+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li>
<li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Pol%22%5BJournal%5D)">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li>
<li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li>
<li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+culture+medium%3A+making+informed+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li>
<li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="https://www.omicsgroup.org/journals/cloning-transgenesis-abstract.php?abstract_id=50992">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li>
</ol>

Los autores proporcionan servicios de transgénesis académica en ratones a través de la Universidad de Nueva Gales del Sur Mark Wainwright Analytical Center.

Pasos críticos dentro del protocolo Se sabe que la generación de ratones modificados genéticamente es técnicamente difícil. Sin embargo, el protocolo presentado aquí es un método optimizado y simplificado que permite dominar y solucionar problemas de la técnica en tiempo récord. Hay dos pasos necesarios para la finalización exitosa de la técnica. En primer lugar, la síntesis de plantillas de ADN lineal (para la síntesis de sgRNAs) se puede lograr sin cloruro de magnesio (MgCl ...

Modelos animales, tanto en vertebrados e invertebrados, han sido fundamentales para examinar la fisiopatología de condiciones humanas como la enfermedad de Alzheimer 1 , 2 . También son herramientas invaluables para buscar modificadores de la enfermedad y, en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento con la esperanza de una cura. Aunque cada modelo tiene limitaciones intrínsecas, el uso de animales como modelos sistémicos enteros es vital para la investigación biomédica. Esto se debe a que el entorno fisiológico metabólico y complejo no puede ser completamente simulado en el cultivo de tejidos. Hasta la fecha, el ratón sigue siendo la especie de mamífero más común utilizada para la manipulación genética, ya que presenta varias ventajas. Los procesos fisiológicos y los genes asociados con enfermedades son altamente conservados entre ratones y humanos. El ratón fue el primer mamífero que tuvo su genoma completo secuenciado (2002), un año antes del genotipo humanoMe (2003). Aparte de esta riqueza de información genética, el ratón tiene buenas capacidades de cría, un ciclo de desarrollo rápido (6 semanas desde la fertilización hasta el destete) y un tamaño razonable. Todas estas ventajas, junto con los indicadores fisiológicos, como los distintos colores de la capa (necesarios para las estrategias de cruce), convirtieron al ratón en un modelo atractivo para la manipulación genética. En particular, en la temprana edad de la genética moderna, Gregor Mendel comenzó a trabajar en ratones antes de pasar a las plantas 3 . Técnicas de transferencia de genes resultó en la generación del primer ratón transgénico hace más de tres décadas 4 , inicialmente creado mediante la administración viral. Sin embargo, los investigadores pronto se dieron cuenta de que uno de los principales retos de la transgénesis del ratón era la incapacidad de controlar el destino del ADN exógeno. Debido a que la entrega viral de transgenes en ovocitos de ratón resultó en múltiples copias integradas al azar en el genoma, el possibilitY de establecer líneas transgénicas posteriores fue limitada. Una de tales limitaciones fue superada cuando Gordon et al. Generó la primera línea de ratón transgénico por microinyección 5 , 6 . Esto comenzó la era de la tecnología del ADN recombinante, y los parámetros que influyen en el resultado de una sesión de microinyección han sido ampliamente estudiados [ 7] . Aunque la microinyección no permite el control sobre el sitio de integración del transgén (que eventualmente da lugar a niveles de expresión específicos para cada ratón fundador), la principal ventaja de la microinjección pronuclear sigue siendo la formación de concatemers ( es decir, matrices de múltiples copias del transgén, Vinculados en serie) antes de la integración genómica 5 . Esta característica se ha utilizado a lo largo de los años para establecer miles de líneas transgénicas de ratón que sobreexpresan un gen de interés. Desde entonces, la transgénesis, la aModificación artificial del genoma de un organismo, se ha utilizado ampliamente para identificar el papel de los genes individuales en la aparición de enfermedades. Otro logro clave en la manipulación del genoma del ratón se alcanzó cuando Mario Capecchi con éxito interrumpido un solo gen en el ratón, abriendo la era de la orientación de genes [ 8] . Sin embargo, los inconvenientes importantes emergieron rápidamente de la orientación de genes basados ​​en células ES, incluyendo los desafíos de cultivar células ES, el grado de quimerismo algo variable y la duración del proceso ( es decir, 12-18 meses, mínimo, para obtener el ratón) . Recientemente, los avances en nuevas tecnologías, tales como las endonucleasas de ingeniería ( por ejemplo, las nucleasas de dedo de cinc (ZFN), las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN) y las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR / Cas9) han surgido como métodos alternativos para Acelerar el proceso de orientación de genes en micrófonoE 9 , 10 . Estas endonucleasas pueden inyectarse fácilmente en ovocitos de ratón mediante microinyección, lo que permite la generación de ratones dirigidos a genes en tan sólo 6 semanas. Desde el primer informe sobre el uso de CRISPR para la edición del genoma 11 , este sistema inmune adaptativo bacteriano ha reemplazado ZFN y TALEN debido a sus muchas ventajas, incluyendo la facilidad de síntesis y la capacidad de apuntar múltiples loci a la vez (denominado &quot;multiplexing &quot;). CRISPR se utilizó por primera vez para la orientación génica en ratones [ 12] y desde entonces se ha aplicado a innumerables especies, de las plantas a los seres humanos [ 13 , 14] . Hasta la fecha, no hay ningún informe de una sola especie resistente a la edición del genoma CRISPR. Los dos pasos limitantes principales de la generación de ratones transgénicos son la inyección de ovocitos y el reimplanteDe estos ovocitos en hembras pseudo-preñadas. Aunque esta técnica ha sido descrita por nosotros 15 y otros 16 , las recientes mejoras técnicas en embriología de ratón y técnicas de transferencia de genes han revolucionado el proceso de generación de ratones genéticamente modificados. Estas mejoras se describirán en el presente documento.

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1,000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Dilute to 1x</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free microinjection buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC microcentrifuge filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR expressing plasmid (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA purification spin columns (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donor plasmid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa embryo culture medium</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Glass microcapillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Vessel clamp</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Clips applier&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis set up</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulators</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Oocytes manipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Mice C57BL/6J strain</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

El uso de ratones modificados genéticamente ha contribuido significativamente a los estudios tanto en procesos fisiológicos y patológicos in vivo . La inyección pronuclear de construcciones de expresión de ADN en oocitos fertilizados sigue siendo la técnica más comúnmente utilizada para generar ratones transgénicos para sobreexpresión. Con la introducción de la tecnología CRISPR para la orientación génica, la inyección pronuclear en ovocitos fertilizados se ha extendido a la generación de ratones knock-out y knockin. Este trabajo describe la preparación de ADN para inyección y la generación de guías CRISPR para la orientación génica, con especial énfasis en el control de calidad. Los procedimientos de genotipado necesarios para la identificación de los posibles fundadores son críticos. Se presentan aquí estrategias innovadoras de genotipado que aprovechan las capacidades de &quot;multiplexación&quot; de CRISPR. También se describen procedimientos quirúrgicos. Juntos, los pasos del protocolo permitirán la generación de genY para el posterior establecimiento de colonias de ratón para una plétora de campos de investigación, incluyendo inmunología, neurociencia, cáncer, fisiología, desarrollo y otros.

A continuación, se describen los flujos de trabajo para la microinyección en el caso de la integración aleatoria y la orientación de genes mediados por CRISPR ( Figura 1 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo típico para la generación de ratones modificados genéticamente. Para la integración a...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes at JoVE.com

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.5K vistas.  University of New South Wales.  La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación. 

Video: Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genética

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

Modelos de ratón de ingeniería genómica somática utilizando microinyección in vivo y electroporación

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Investigación sobre el cáncer

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento de inyección de espermatida redonda murina para estudiar el desarrollo embrionario

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Inyección de espermatida redonda de ratón

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Inyección de espermatida redonda de ratón

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

Resumen

Explorar más videos

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Modelos de ratón de ingeniería genómica somática utilizando microinyección in vivo y electroporación

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía