Name: generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Tierfabrik (BRC) für ihre laufende Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom National Health and Medical Research Council und dem Australian Research Council finanziert.

Alle Verfahren wurden von der University of New South Wales Animals Care und Ethics Committee genehmigt. 1. Vorbereitung des Transgens (Random Integration) <ol><li> Analytische Agarose-Gelelektrophorese. <ol><li> Das Plasmid wird unter Verwendung geeigneter Enzyme (1 h Inkubation) oder Fast-Digest-Enzymen (15 bis 30 min Inkubation) in einem Thermocycler nach den Empfehlungen des Herstellers untersucht (siehe Abbildung 2A und seine Legende). </li><li> Es wurde ein 1% iges Trisacetat-Ethylendiamintetraessigsäure- (EDTA) (TEA) -Affarosegel gegossen, das mit 0,5-1,0 μg / ml Ethidiumbromid (EtBr) gefärbt ist. HINWEIS: Bei der Verwendung von EtBr Vorsicht walten lassen. Es ist ein starkes mutagen. Bitte geeignete Schutzausrüstung verwenden (siehe Sicherheitsdatenblatt). </li><li> Laden Sie eine 1 kb Molekulargewichtsmarkierung. </li><li> Laden Sie die linearisierten Fragmente ( dh Transgen und Backbone). </lI&gt; <li> Führen Sie die Elektrophorese bei 100 V für 45 min. </li><li> Visualisieren Sie das Gel auf einem Ultraviolett- (UV) Transilluminator, um zu überprüfen, ob die Verdauung vollständig ist, und um die korrekte Größe des Transgens zu bestätigen ( dh 7,338 bp, siehe Abbildung 2A ). </li></ol></li><li> Präparative Agarose-Gelelektrophorese <ol><li> Gießen Sie ein 1% TAE-Agarosegel, gefärbt mit einem niedrigen Toxizitätsgelfleck. Laden Sie 8 Aliquots (je 1 μg) linearisiertes Transgen ohne Molekulargewichtsmarker und führen Sie die Elektrophorese bei 100 V für 45 min durch. Verwenden Sie ein Skalpell, um alle 8 Bänder, die dem linearisierten Transgen entsprechen, zu exzimieren. </li><li> Extrahieren Sie die DNA mit einem Gel-Extraktionskit, indem Sie den Empfehlungen des Herstellers folgen (siehe Tabelle der Materialien ). <ol><li> Die Gelfragmente bei 50 ° C in 1,5-ml-Röhrchen für mindestens 15 min schmelzen. Mit Isopropanol abfließen und dann den Bindungspuffer zugeben. </li><li> Kombiniere die gesamte DNA durch Pipettieren alles in eine Spalte. Eluieren in nukleasefreien Mikroinjektionspuffer (8 mM Tris-HCl und 0,15 mM EDTA). Durch einen 0,22 μm Mikrozentrifugenfilter filtrieren und 60 s bei 12.000 x g zentrifugieren. </li></ol></li><li> Messen Sie die Konzentration und die Qualität der DNA mit einem Spektrophotometer. Prüfen Sie, ob das A260 / A280-Verhältnis etwa 1,8 beträgt ( dh keine Verunreinigung durch Proteine) und das A260 / A230-Verhältnis mindestens 2,0 ( dh keine Kontamination durch organische Lösungsmittel). Bis zu 3 ng / μl in nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer, Aliquot (20-50 μl) und bei -20 ° C einfrieren. </li></ol></li></ol> 2. Synthese von CRISPR-Komponenten (Gen-Targeting) <ol><li> Cas9-mRNA <ol><li> Verdünnen Sie die Cas9-mRNA (erhalten aus einer kommerziellen Quelle, siehe Tabelle der Materialien ) bis zu einer Konzentration von 1 μg / μL in nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer. </li><li> Aliquot in 2 μl und frei<html> Ze bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Single-Guide-RNA (SGRNA). <ol><li> Identifizieren Sie die gewünschten Zwei-Ziel-Genom-Sequenzen (Guides) mit einem rechnerischen Design-Tool ermöglicht minimale potenzielle Off-target-Aktivität 17 . <ol><li> Für Gen-Knockout, systematisch wählen Sie zwei Führer, die ein paar hundert Basenpaare (bp) auseinander, in entgegengesetzte Richtungen, und enthalten die Start-Codon des Gens von Interesse. Für die Homologie direkt reparieren, wählen Sie zwei überlappende Führungen (wann immer möglich), in entgegengesetzte Richtungen. HINWEIS: Als Beispiel wurden die folgenden Guides vor kurzem erfolgreich zusammengespritzt, um das erste Exon des TPM4.2- Gens zu stören: Leitfaden 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Leitfaden 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Bestellen Sie einen Satz von Primern wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Synthese einer linearen DNA-Matrize. <ol><li> Verdünnen px330Ref &quot;&gt; 12 Plasmid auf 10 ng / μL in nukleasefreiem Wasser. </li><li> Bereiten Sie den Master-Mix wie in Tabelle 1 angegeben vor. Füge die Polymerase am Ende hinzu und halte die Mastermischung auf Eis. </li><li> Mischen und auf 8 PCR-Röhrchen (19 μl / Tube) aufteilen. Füge 1 μl px330 pro Röhrchen hinzu und laufe die PCR unter folgenden Bedingungen: 1 min bei 98 ° C; 40 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 64 ° C für 30 s und 72 ° C für 15 s; Und eine Enddehnung bei 72 ° C für 5 min. Bei 4 ° C halten. </li><li> Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit (siehe Tabelle der Materialien ), einer Mannigfaltigkeit und einer Vakuumquelle (für eine schnellere Verarbeitung). Die maximale Vakuumstärke ( dh 8 mbar) auftragen. <ol><li> Füge 5 Volumina (100 μl) Bindungspuffer zu 1 Volumen der PCR-Probe hinzu und vermische. </li><li> Legen Sie eine (vorgesehene) Siliciumdioxid-Membran-Spin-Säule in ein (mitgeliefertes) 2-ml-Sammelrohr für die Zentrifugation oder auf den Verteiler für Vakuumverfahren einIng. Um DNA zu binden, sukzessive alle 8 Proben auf die Säule auftragen und vakuumieren oder für 60 s bei 12.000 xg für jede Ladung zentrifugieren. </li><li> Zum Waschen werden 0,75 ml Waschpuffer (Puffer PE) in die Säule gegeben und für 60 s bei 12.000 x g vakuumiert oder zentrifugiert. Die Säule für 60 s bei 12.000 xg zentrifugieren, um restliches Ethanol zu entfernen. </li><li> Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die DNA zu eluieren, füge 30 μl nukleasefreies Wasser in die Mitte der Membran hinzu, lasse die Säule 1 min stehen und zentrisch für 60 s bei 12.000 g </li></ol></li><li> Messen Sie die Konzentration mit einem Spektrophotometer; Typischerweise sollte die Konzentration 100 ng / μL oder höher betragen. Prüfen Sie, ob das A260 / A280-Verhältnis etwa 1,8 beträgt ( dh keine Verunreinigung durch Proteine) und das A260 / A230-Verhältnis mindestens 2,0 ( dh keine Kontamination durch organische Lösungsmittel). </li></ol></li><li> In-vitro- Transkription unter Verwendung eines T7-RNA-Synthesekits. <ol><li> Vorbereitung tEr mischte, wie in Tabelle 1 angegeben, und inkubieren für 3 h bei 37 ° C in einem Thermocycler. Füge 28 μl nukleasefreies Wasser und 2 μl DNase I hinzu und inkubiere weitere 15 min bei 37 ° C in einem Thermocycler. </li></ol></li><li> RNA-Reinigung mit Spin-Säulen. <ol><li> Lösen Sie das in der bereitgestellten Spinsäule enthaltene Pulver in 650 μl nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer, wobei alle Luftblasen sorgfältig entfernt werden. Das Röhrchen umhüllen und 5 bis 15 min bei Raumtemperatur hydratisieren. </li><li> Entfernen Sie die blaue Kappe an der Unterseite und legen Sie die Säule in ein 2-ml-Rohr. 2 min bei 750 xg und Raumtemperatur zentrifugieren. Die Säule in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen geben und 50 μl der RNA-Lösung tropfenweise in die Mitte geben, ohne die Säulenwand zu berühren. Spin die Säule für 2 min bei 750 x g. </li><li> Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer (die typische Ausbeute einer Reaktion beträgt 30 - 50 μg). Prüfen Sie, ob das A260 / A280-Verhältnis a istRunde 2.0 ( dh keine Verunreinigung durch Proteine) und das A260 / A230-Verhältnis beträgt mindestens 2,0 ( dh keine Verunreinigung durch organische Lösungsmittel). Die sgRNAs bei -80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. </li><li> Beurteilen Sie die Qualität der RNA unter Verwendung der 1% TAE-Gele, die routinemäßig für die DNA-Elektrophorese verwendet werden. Führen Sie 200-400 ng der DNA-Matrize und die entsprechende sgRNA parallel aus. Die RNA-Bande (≈ 100 bp) sollte etwas größer sein als die DNA-Bande (siehe Abbildung 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Spendervorlage <ol><li> Bestellen von kommerziell synthetisierten einzelsträngigen Oligonukleotiden (ssOligos, siehe Tabelle der Materialien ) für Punktmutationen oder für die Integration von kleinen Sequenzen bis zu 50 bp; Homologiearme sind typischerweise 60-90 bp lang. </li><li> Für größere Insertionen verwenden Sie ein Spenderplasmid als Vorlage. Erzeugung eines geeigneten Plasmids unter Verwendung der klassischen Klonierungsmethode oder der de novo - Synthese aus einemKommerzielle Quelle. HINWEIS: Es werden mindestens 800 bp pro Homologiearm empfohlen. Die Größe des Rückgrats hat keinen Einfluss auf die Effizienz der Homologie-Direktreparatur (HDR). </li></ol> 4. Injektionsmischung <ol><li> Verdünnen Sie die Cas9-mRNA auf 50 ng / μl und die sgRNAs auf 12,5 ng / μL (insgesamt 25 ng / μL) unter Verwendung von nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer für Gen-Knockout-Experimente. Fügen Sie die Spender-Matrize (ssOligo oder Plasmid) in einer Konzentration von 200 ng / μL für Genom-Editing-Experimente auf der Grundlage von Homologie direkte Reparatur. HINWEIS: Verdünnungsvolumina können mit Hilfe von Online-Tools, wie z. B. einem Resuspensionsrechner, leicht ermittelt werden. </li><li> Halten Sie jedes Aliquot auf Eis während der Mikroinjektionssitzung und verwerfen Sie danach (nicht wieder einfrieren die Einspritzung Mischung). </li></ol> 5. Skrotal-Vasektomie ANMERKUNG: Zwei Arten von Vasektomie werden häufig bei Mäusen durchgeführt: Bauch und Skrotal. LetztereIst weniger invasiv und wurde zuvor beschrieben 15 . <ol><li> Autoklav alle chirurgischen Instrumente aus rostfreiem Stahl. </li><li> Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit einer Waage und betäubt die Männchen durch intraperitoneale (ip) Injektion mit injizierbarem Anästhetikum (Ketamin 100 mg / kg, Xylazin 10 mg / kg). </li><li> Überwachen Sie den Verlust des Zehen-Quetsch-Reflexes und sobald die Maus sediert ist, legen Sie sie auf ein Heizkissen. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut um die Hoden mit wechselnden Tüchern eines topischen Antiseptikums wie Chlorhexidin und 70% Ethanol. </li><li> Schieben Sie die Hoden in den Skrotalsack und machen Sie einen Hautschnitt mit einem Skalpell. </li><li> Visualisierung der Hoden, Cauda-Nebenhoden und Vas deferens. </li><li> Greife die Vas deferens mit Pinzette, halte sie und kauterisiere auf jeder Seite der Pinzette, um 3 mm der Vas deferens zu entfernen. </li><li> Führen Sie das gleiche Verfahren auf dem zweiten Testis durch. </li><li> Schließen Sie die Hautinzisionen mit Wundclips und überwachen Sie dieMaus bis zur vollständigen Erholung. </li></ol> 6. Superovulation (Oozytenspender) und Zeitmessung (Pseudo-schwangere Frauen) HINWEIS: Die Technik zur Erzeugung einer geeigneten Anzahl von befruchteten Oozyten und verstopfte Pflegefrauen zur Reimplantation wurde an anderer Stelle beschrieben 15 . <ol><li> Injizieren Sie 10 Frauen mit 5 IE des Serum Gonadotropins der schwangeren Stute (PMSG; in 100 μl) um 12 Uhr am Tag 1. </li><li> Injizieren Sie die Weibchen ip mit 5 IE menschlichem Choriongonadotropin (hCG, in 100 μl) 46-48 h später (um 11 Uhr am Tag 3). </li><li> Sofort beruhigen die Weibchen mit Eingeborenen über Nacht. </li></ol> 7. Pronukleare (zufällige Integration) und zytoplasmatische (Gene-Targeting) Injektionen <ol><li> Cull die superovulierten Mäuse durch zervikale Versetzung, entlasten den Bauch und greifen auf die Eierstöcke und Ovidukte, wie zuvor beschrieben 15 . Dissect die oViducts und ernten die Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) unter einem Stereomikroskop 15 . Legen Sie sie in einen Tropfen Kalium-Simplex-Optimierungsmedium, ergänzt mit Aminosäuren (KSOMaa) nach dem traditionellen Verfahren 15 . </li><li> Die Oozyten werden durch Zugabe von ca. 1 &amp; mgr; l Hyaluronidase (10 mg / ml) zum Tropfen KSOMaa-Medium unter Verwendung eines Aspirationsmundstücks zugegeben und die Schale in einen 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator für 30 s bis 1 min gegeben. </li><li> Die Oozyten mit 4 frischen Tropfen KSOMaa-Medium mit dem Aspirator-Mundstück waschen und auf einen endgültigen Tropfen KSOMaa-Medium überführen, der mit Mineralöl (ca. 2 ml) überzogen ist. Legen Sie die Schale in den 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator, bis die Oozyten zur Injektion bereit sind. </li><li> Pronukleare Injektion (zufällige Integration). <ol><li> Die Eier unter dem stereoskopischen Mikroskop visualisieren und ca. 50 Eier in die Injektionskammer bringen (a droP von M2 Medium mit Mineralöl überlagert) mit dem Aspirator Mundstück. </li><li> Übertragen Sie die Injektionskammer auf das invertierte Mikroskop und injizieren Sie die befruchteten Oozyten (zwei sichtbare Vorkerne) mit einigen Picolitern der Injektionsmischung, die auf einen Vorkern abgestimmt sind (jeder der Vorkern kann gezielt werden). Manifestiere eine erfolgreiche Injektion durch Beobachtung der Schwellung des Vorkerns. </li></ol></li><li> Zytoplasmatische Injektion (Gen-Targeting). <ol><li> Übertragen Sie etwa 50 Eier zu einem Tropfen KSOMaa mit 5 μg / ml Cytochalasin B mit dem Mundstück und inkubieren für 5 min im 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Übertragen Sie die Eier mit dem Mundstück in die Injektionskammer. </li><li> In den Zytoplasma bei sehr niedrigem Druck (50-100 hPa) wenige Pikoliter der Injektionsmischung einspritzen, wobei der Kompensationsdruck des automatisierten Mikroinjektors nach Möglichkeit möglich ist. </li><li> Nach der Injektion die Oozyten wieder in einen Tropfen KSO überführenMaa (mit dem Mundstück) und halten sie im 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator, bis zur Reimplantation in den Eileiter der pseudo-schwangeren Frauen geladen. </li></ol></li></ol> 8. Reimplantation <ol><li> Autoklav alle chirurgischen Instrumente aus rostfreiem Stahl. </li><li> Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit der Waage und betäubt die Weibchen durch intraperitoneale (ip) Injektion mit injizierbarem Anästhetikum (Ketamin 100 mg / kg, Xylazin 10 mg / kg). </li><li> Überwachen Sie den Verlust des Zehen-Quetsch-Reflexes und sobald die Maus sediert ist, legen Sie sie auf ein Heizkissen. </li><li> Clip eine große Fläche des Pelzes um die dorsale Mittellinie der weiblichen Maus. </li><li> Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit abwechselnden Tüchern eines topischen Antiseptikums wie Chlorhexidin und 70% Ethanol. </li><li> Exponieren Sie den Fortpflanzungstrakt nach der traditionellen Methode 15 . Machen Sie einen 1 cm langen Hautschnitt parallel zur dorsalen Mittellinie, schneiden Sie den Muskel ab und packen Sie den fetten Pad wiTh eine Pinzette, dann sanft ziehen die Eierstöcke aus, bis seine beigefügten Eileiter und Uterus deutlich sichtbar sind. </li><li> Fix das Fett-Pad mit einer Gefäßklemme. Visualisieren Sie den Eileiter unter dem stereoskopischen Mikroskop und verwenden Sie ein Paar Mikro-Schere machen einen Einschnitt in die Wand des Ovidukt wenige Millimeter stromaufwärts der Ampulle. </li><li> Unter dem stereoskopischen Mikroskop laden 25 mikroinjizierte Eier in die Glaskapillare, die mit dem Mundstück verbunden ist (der Innendurchmesser der Kapillare sollte etwa 120 μm breit sein). Füge die Glaskapillare in den Eileiter ein und vertreibe, bis eine Luftblase in der Ampulle sichtbar ist. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Glaskapillare und legen Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in den Bauch. Naht den Einschnitt mit 3-0 nicht resorbierbaren chirurgischen Nähten, dann schließen mit Wundclips. Überwachen Sie die Maus genau bis zur vollständigen Wiederherstellung. </li></ol> 9. Genotypisierungsstrategien / Sequenzierung HINWEIS: Das Genom isolierenDNA aus 2-mm-Schwanz- oder Ohrenbiopsien, nach relevanten Tierethikvorschriften. <ol><li> Schnelle genomische DNA-Extraktion (zufällige Integration). <ol><li> Lyse die Gewebeproben (~ 2 mm) bei 95 ° C für 1 h in 100 μl alkalischem Lyse-Reagenz (25 mM Natriumhydroxid und 0,2 mM EDTA, pH = 12). </li><li> 100 μl Neutralisationsreagenz (40 mM Tris-HCl, pH = 5) zugeben. </li><li> 5 min bei 12.000 g und 4 ° C zentrifugieren. </li></ol></li><li> Hochwertige genomische DNA-Extraktion (Gen-Targeting). <ol><li> Fügen Sie 500 μl Schwanzpuffer (50 mM Tris, pH = 8, 100 mM EDTA, pH = 8, 100 mM NaCl, 1% SDS und 0,5 mg / ml Proteinase K, frisch zugesetzt) ​​hinzu. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 55 ° C. </li><li> Mischen für 5 min durch Invertieren (nicht vortexen). </li><li> Zugabe von 250 μl gesättigtem NaCl (6 M) und Mischen für 5 min durch Invertieren (nicht vortexen). </li><li> Für 5-10 min bei 12.000 xg und 4 ° C drehen und den Überstand in neues Röhrchen geben. </lI&gt; <li> Fügen Sie 500 μl Isopropanol hinzu und mischen für 5 min durch Invertieren (nicht vortexen). </li><li> Für 10 min bei 12.000 xg und Raumtemperatur drehen. </li><li> Dekantieren den Überstand (das Pellet ist unsichtbar und haftet an der Tube). </li><li> Mit 1 ml 70% igem Ethanol waschen. </li><li> Spin für 5-10 min bei 12.000 xg und Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig, da das weiße Pellet nicht mehr klebrig ist und verloren gehen kann. </li><li> Luft trocknen diese für ~ 1 h. </li><li> Man gibt 400 μl TE-Puffer (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH = 8) zu. </li><li> Die DNA bei 55-60 ° C für 2 h auflösen. </li></ol></li><li> Grundierung Design. <ol><li> Entwerfen Sie Primer ein Minimum von 20 bp lang mit einem Rechenwerkzeug 19 . HINWEIS: Für die zufällige Integration sollten die Primer mit dem Transgen hybridisieren und ein unterschiedliches Fragment von 200-800 bp erzeugen. Für die Gen-Targeting, die Primer so zu gestalten, dass sie mit der genomischen DNA hybridisieren, wodurch eine deutliche fRennen ein paar hundert Bp um die geschnittenen Seiten. Für große Insertionen können die Primer auf dem Transgen sitzen, aber die Bestätigung der gezielten Integration sollte anschließend mit Primer Walking oder einer ähnlichen Technik durchgeführt werden. </li></ol></li><li> PCR-Genotypisierung. <ol><li> Für jede genomische Modifikation, entwerfen Sie ein neues PCR-Protokoll und testen Sie es empirisch. Man betrachte die Länge des erzeugten Fragments und die Schmelztemperatur (Tm) jedes Paares von Primern. </li></ol></li><li> Sequenzierung. <ol><li> Für Gen-Targeting, senden PCR-Produkte an einen Sanger Sequenzierung Dienstleister. </li></ol></li></ol>

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L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum.">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li><li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection.">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li><li>Biggers, J. D., Summers, M. 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Die Autoren bieten akademische Transgenese Dienstleistungen in Mäusen über die University of New South Wales Mark Wainwright Analytical Center.

Kritische Schritte im Protokoll Die Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen ist technisch anspruchsvoll. Allerdings ist das hier vorgestellte Protokoll eine optimierte und vereinfachte Methode, die es ermöglicht, die Technik in Rekordzeit zu beherrschen und zu beheben. Für den erfolgreichen Abschluss der Technik sind zwei Schritte erforderlich. Zuerst kann die Synthese von linearen DNA-Matrizen (für die Synthese von sgRNAs) ohne Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) erreicht werden. Es ...

Tiermodelle, sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen, waren maßgeblich für die Untersuchung der Pathophysiologie menschlicher Zustände wie der Alzheimer-Krankheit 1 , 2 . Sie sind auch unschätzbare Werkzeuge, um nach Krankheitsmodifikatoren zu suchen und letztlich neue Behandlungsstrategien in der Hoffnung auf eine Heilung zu entwickeln. Obwohl jedes Modell intrinsische Einschränkungen hat, ist die Verwendung von Tieren als ganze systemische Modelle für die biomedizinische Forschung unerlässlich. Denn die metabolische und komplexe physiologische Umgebung kann nicht vollständig in der Gewebekultur simuliert werden. Bis heute bleibt die Maus die häufigste Säugetierart, die für die genetische Manipulation verwendet wird, da sie mehrere Vorteile aufweist. Die physiologischen Prozesse und Gene, die mit Krankheiten assoziiert sind, sind zwischen Mäusen und Menschen hoch konserviert. Die Maus war der erste Säugetier, um sein volles Genom sequenziert zu haben (2002), ein Jahr vor dem menschlichen GenoIch (2003). Abgesehen von diesem Reichtum an genetischer Information hat die Maus gute Zuchtkapazitäten, einen schnellen Entwicklungszyklus (6 Wochen von der Befruchtung bis zur Entwöhnung) und eine vernünftige Größe. Alle diese Vorteile, verbunden mit physiologischen Indikatoren, wie unterschiedliche Fellfarben (erforderlich für Crossing-Strategien), machte die Maus ein attraktives Modell für die genetische Manipulation. Vor allem in der frühen Zeit der modernen Genetik begann Gregor Mendel, an Mäusen zu arbeiten, bevor er zu Pflanzen ging 3 . Gentransfer-Techniken führten zur Erzeugung der ersten transgenen Maus über drei Jahrzehnte her 4 , die anfänglich mit viraler Verabreichung hergestellt wurde. Allerdings erkannten die Forscher bald, dass eine der Hauptaufgaben der Maus-Transgenese die Unfähigkeit war, das Schicksal der exogenen DNA zu kontrollieren. Weil die virale Abgabe von Transgenen in Maus-Oozyten dazu geführt hat, dass mehrere Kopien zufällig in das Genom integriert wurden, die MöglichkeitY der Herstellung nachfolgender transgener Linien war begrenzt. Eine solche Einschränkung wurde überwunden, als Gordon et al. Erzeugte die erste transgene Mauslinie durch Mikroinjektion 5 , 6 . Dies begann die Ära der rekombinanten DNA-Technologie, und die Parameter, die das Ergebnis einer Mikroinjektionssitzung beeinflussen, wurden weitgehend untersucht 7 . Obwohl die Mikroinjektion keine Kontrolle über die Integrationsstelle des Transgens erlaubt (was schließlich zu spezifischen Expressionsniveaus für jede Gründermaus führt) bleibt der Hauptvorteil der vorkernigen Mikroinjektion die Bildung von Concatemern ( dh Arrays von mehreren Kopien des Transgens, Verknüpft in Serie) vor der genomischen Integration 5 . Dieses Merkmal wurde im Laufe der Jahre verwendet, um Tausende von transgenen Mauslinien zu etablieren, die ein Gen von Interesse überexprimieren. Seitdem, transgenese, die aRtificiale Modifikation des Genoms eines Organismus wurde weitgehend verwendet, um die Rolle einzelner Gene beim Auftreten von Krankheiten zu identifizieren. Eine weitere wichtige Errungenschaft bei der Manipulation des Mausgenoms wurde erreicht, als Mario Capecchi erfolgreich ein einziges Gen in der Maus unterbrach und die Ära des Gen-Targeting 8 öffnete. Allerdings traten grundsätzliche Nachteile schnell aus dem ES-zellbasierten Gen-Targeting hervor, einschließlich der Herausforderungen der Kultivierung von ES-Zellen, des etwas variablen Chimäritätsgrades und der Länge des Prozesses ( dh 12-18 Monate, minimal, um die Maus zu erhalten) . In jüngster Zeit haben sich Fortschritte bei neuen Technologien wie z. B. konstruierte Endonukleasen ( z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALEN) und gruppierten regelmäßig zusammengesetzten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR / Cas9) als alternative Methoden ergeben Beschleunigen den Prozess der Gen-Targeting in micE 9 , 10 Diese Endonukleasen können durch Mikroinjektion leicht in Mausozyten injiziert werden, was die Erzeugung von Gen-gezielten Mäusen in nur 6 Wochen ermöglicht. Seit dem ersten Bericht über die Verwendung von CRISPR für die Genombearbeitung 11 hat dieses bakterielle adaptive Immunsystem ZFN und TALEN aufgrund seiner vielen Vorteile, einschließlich der Leichtigkeit der Synthese und der Fähigkeit, mehrere Loci auf einmal (als &quot;Multiplexing&quot; bezeichnet) ersetzt &quot;). CRISPR wurde zuerst für Gen-Targeting in Mäusen 12 verwendet und ist seitdem auf unzählige Arten angewendet worden, von Pflanzen auf Menschen 13 , 14 . Bisher gibt es keinen Bericht über eine einzige Art, die gegen CRISPR-Genom-Bearbeitung resistent ist. Die beiden Hauptbegrenzungsschritte der Erzeugung von transgenen Mäusen sind die Injektion von Oozyten und die ReimplantationDieser Oozyten zu pseudo-schwangeren Frauen. Obwohl diese Technik von uns 15 und anderen 16 beschrieben worden ist, haben die jüngsten technischen Verbesserungen bei der Mausembryologie und den Gentransfertechniken den Prozess der Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen revolutioniert. Diese Verbesserungen werden hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1,000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Dilute to 1x</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free microinjection buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC microcentrifuge filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR expressing plasmid (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA purification spin columns (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donor plasmid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa embryo culture medium</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Glass microcapillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Vessel clamp</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Clips applier&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis set up</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulators</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Oocytes manipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Mice C57BL/6J strain</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

Die Verwendung von genetisch veränderten Mäusen hat wesentlich zu Studien an physiologischen und pathologischen In-vivo- Prozessen beigetragen. Die nukleare Injektion von DNA-Expressionskonstrukten in befruchtete Oozyten bleibt die am häufigsten verwendete Technik, um transgene Mäuse für die Überexpression zu erzeugen. Mit der Einführung der CRISPR-Technologie für das Gen-Targeting wurde die nukleare Injektion in befruchtete Oozyten auf die Erzeugung von Knockout- und Knockin-Mäusen ausgedehnt. Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von DNA für die Injektion und die Generierung von CRISPR-Guides für das Gen-Targeting mit besonderem Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle. Die für die Identifikation von potentiellen Gründern erforderlichen Genotypisierungsverfahren sind entscheidend. Innovative Genotypisierungsstrategien, die die &quot;Multiplexing&quot; -Fähigkeiten von CRISPR nutzen, werden hier vorgestellt. Auch chirurgische Verfahren werden skizziert. Gemeinsam werden die Schritte des Protokolls die Erzeugung von Gen ermöglichenEtikodisch modifizierte Mäuse und für die anschließende Etablierung von Mauskolonien für eine Fülle von Forschungsfeldern, einschließlich Immunologie, Neurowissenschaften, Krebs, Physiologie, Entwicklung und andere.

Im Folgenden werden die Arbeitsabläufe für die Mikroinjektion im Falle der zufälligen Integration und des CRISPR-vermittelten Gen-Targeting beschrieben (Abbildung 1 ). <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Abbildung 1: Typischer Workflow zur Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen. Für die zufällige Integration wird...

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Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.5K Aufrufe.  University of New South Wales.  Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien. 

Serie: Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Krebsforschung

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung