Name: generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
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著者らは、継続的な支援のために動物施設（BRC）のスタッフに感謝しています。この研究は、国家保健医療研究評議会とオーストラリア研究評議会によって資金提供された。

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著者らは、ニューサウスウェールズ大学のMark Wainwright Analytical Centerを介して、マウスで学術的トランスジェニックサービスを提供しています。

プロトコル内の重要なステップ遺伝子組み換えマウスの作製は技術的に困難であることが知られている。しかし、ここで提示されたプロトコルは、記録的な時間に技術をマスターし、トラブルシューティングを行うことを可能にする、最適化され単純化された方法である。この技法をうまく完了するためには、2つのステップが必要である。第一に、線状DNA鋳型（sgRNAの合成用）の合成は、塩化マグネシウム（MgCl 2 ）なしで達成することができる。しかし、フォワードプライマーの部分的ハイブリダイゼーションは、MgCl 2が存在しない場合にしばしば防止されるので、マスターミックスにMgCl 2を系統的に添加することが強く推奨される。さらに、ターゲティングされたゲノム配列がドナー鋳型のどの部分にも存在しないことが重要である（標的化された組み込みの場合）。そうしないと、Cas9ヌクレアーゼが切断してHDRの発生を防止する。 変更トラブルシューティング遺伝子組み換えマウスを作製するためのこのプロトコールは、長年にわたって最適化され、合理化されてきたが、マイクロインジェクションのための良質の卵母細胞の収率および養子の目詰まり率に関するいくつかの考慮事項がある。バックグラウンド株の選択は、マイクロインジェクションセッションに起因する生存仔の数に関して重要である。 C57BL / 6は、マウスモデルの疾患の最も一般的に用いられる背景である。しかし、それはまた、マイクロインジェクション20に対する抵抗の点で、効率の低いバックグラウンドの1つです。さらに、雌の年齢はまた、多数の卵母細胞を産生するために重要である。これは、ホルモン刺激21に対する応答の最も好ましくない期間であるため、背景にかかわらず、マウスを5〜8週齢で避けることが推奨される21 。我々の経験では、3〜4週齢のC57BL / 6マウスは女性1匹当たり20〜30卵を確実に産生する。のは大事です新しい技術（超超排卵と呼ばれる）が女性1匹につき100卵まで生産し、最近はマイクロインジェクション22のための卵母細胞を生成するために使用されていることに注意してください。しかしながら、マイクロインジェクションのための超超排卵の使用は、一般に、そのような多数の卵を人為的に受精させる（ インビトロ受精）必要性によって妨げられる。 再移植に適した詰まった雌を得るために、雌マウスを精管切除した雄と交配させる（これらのマウスのバックグラウンドは重要ではない）。詰まらせた受診者の数を増やすには、発情段階と適切な女性の選択を注意深く検討することができます23 。女性の周期の同期化はまた、交配の2日前に女性を精管切除された男性に曝露することによって誘導することができる（いわゆる「Whitten効果」）。 技術の限界点突然変異のような非常に小さなゲノム改変は、生成するのが比較的容易であるが、それらを同定することは困難である。遺伝子型決定が行われる場合、PCR産物はサンガー配列決定によって直接配列決定される。しかしながら、Cas9がかなりの時間活性を維持し、異なるゲノム改変が卵母細胞の最初の分裂後に起こり得るので、マウス卵母細胞へのCRISPR成分の直接的マイクロインジェクションは、モザイク動物を生成することが多い。この交絡作用は、様々な対立遺伝子間の離散変異の同定を複雑にし、次世代シークエンシング（NGS）は挑戦的な読み出しに役立ちます。敏感な技術、例えばテトラプライマーARMS-PCR 25は、シーケンシングによって創始者の同定後にコロニーを遺伝子型決定することにも役立つ。 逆に、標的とされた様式でDNAの大きな断片を挿入することは困難なままである。外来性DNAが大きければ大きいほど、HDRの効率は低くなる。その結果、長いssOligosドナー（プラスミドの代わりに） 26またはHDR非依存性の標的化された組み込み27のような新しい戦略が現在開発されている。 プロトコルの意義このプロトコールは、4つの主要なステップ（ すなわち導入遺伝子またはCRISPR成分の調製、マイクロインジェクション、再移植および遺伝子タイピング）が我々の研究室で最適化され、試験され、検証されているため、 トランスジーンのランダムな組込みは、2つの主な理由で過剰発現研究に広く使用されている。まず、avoにその潜在的な「ポジション効果」は、HDRの効率が低いため、Rosa26 28およびCol1a 29遺伝子座などの「安全な港」の遺伝子座におけるCRISPRを用いた導入遺伝子の標的統合は依然として挑戦的である。この問題を克服する戦略は今後の予定である26,27であるが 、これまでランダムな統合がより効率的であることが証明されている。さらに、異なるレベルの発現を有する同じ導入遺伝子を過剰発現する複数のトランスジェニック系統の生成は、表現型30を逆転させる治療戦略を含む研究において重要である。目的とするタンパク質の発現のために必須の断片を組み立てるために、 アドホックな制限酵素を用いて、クローニングの手段によってプラスミドに基づく導入遺伝子を生成する。一般に、導入遺伝子は、少なくとも3つの要素から作製される：適切なプロモーター（エンハンサー領域が時々加えられる）;コーディングイントロン領域を伴うかまたは伴わない配列（cDNA）; mRNA発現を安定化させるためのPolyAテイル31 。 一旦組み立てられると、トランスジーンは細菌複製エレメントを含むプラスミドに挿入され、形質転換後に培養物中で増殖する（典型的には熱ショックに基づく）。マイクロインジェクションのためのトランスジーンの精製方法は重要である。この研究は、（従来のクリスタルバイオレットと比較して）ゲル上の関心フラグメントのより正確な視覚化および低い変異原性暴露（臭化エチジウムと比較して）のための新世代（低毒性）DNA染色の使用を記載する。 本明細書に記載される遺伝子標的化のための非クローニング法は非常に速く、わずか5〜6時間でいくつかのsgRNAの合成を可能にする。ターゲット配列の同定、T7プロモーターおよび選択された標的配列を含む線状DNA鋳型の合成、インビトロ転写（IVT）によるsgRNA、およびスピンカラムを用いたsgRNAの精製が含まれる。 CRISPRマウスゲノム編集の初期段階では、マウス胚では非常に限られていることが示されていたが、選択されたマウスが唯一の育種スキームの手段によって容易に希釈され得るが、潜在的なオフターゲット効果が系統的に評価された所望のゲノム改変。オンターゲットの活動は、 インビトロで系統的に事前に評価され 、異なるガイドを使用し、より活性なものを選択した12 。いくつかの理由から、このプラクティスはあまり一般的ではありません。最初に、CRISPRをコードするプラスミドで不死化マウス細胞株（典型的にはN2aまたはNIH3T3）のトランスフェクションを使用して、標的とする活性を評価する。これは、マウス卵母細胞へのCRISPR RNA成分の注入とは異なる方法である。したがって、 インビトロで見出された結果は、必ずしも均等に翻訳されるわけではない卵母細胞にさらに、ハイスループット実験は、ほとんどのガイドが活性であることを示した33 。その結果、標的上の活性は評価されず、これまでマウス卵母細胞において活性を示さないガイドの証拠はなかった。ここに示したsgRNAを合成する非クローニング法と合わせて、ワークフローを大幅に簡素化し合理化し、複数のアクティブなガイドを1日でシームレスに合成することができます。 CRISPRは、技術が実行される方法を変えるイノベーションである「破壊的な技術」と考えられています。マイクロインジェクションが確立されたとき、Brinster et al。達成可能ではあるが、細胞質の遺伝子導入はほとんど非効率的であることを示した7 。結果的に、前核マイクロインジェクションは、マウスで標的とするCRISPR遺伝子の成功の最初の実証まで、ほぼ30年間、唯一の一般的なプラクティスであった。この研究は、細胞質マイクロインジェクション<html>前核の送達と比較して同様の、または優れた結果を生み出すことができる12 。明らかに、CRISPR成分は典型的にRNAで作られているので、細胞質が標的にされていることは明らかである。しかし、細胞質に注入された場合でも、ドナーテンプレートはHDRを首尾よく誘導することができる。テンプレートの高い細胞質濃度は、それらの核への拡散を可能にする。さらに、ピエゾ駆動細胞質マイクロインジェクション16の使用は要件ではない。サイトカイン阻害剤（例えば、サイトカラシンB）との卵母細胞の短いインキュベーションは、卵母細胞34,35の生存を増加させ、ピエゾインパクト駆動システムなしで細胞質注入を行うのに十分である。同様に、KSOMaaのような改良された培養培地の使用は、2細胞期における閉塞を減少させ、M16培地と比較して胚の発生能力を改善するxref &quot;&gt; 36。 1細胞または2細胞（一晩培養した場合）の胚を卵管に移すことができる。従来の処置は、卵巣を保護する嚢を引き裂く必要があるので、非常に侵襲的である。また、ガラス毛細管を腔内に挿入する必要があるため、技術的にも挑戦的である15 。ここに示した方法は、習得がはるかに容易であり、潜在的な出血を誘発せず、卵巣の完全性を保持する。熊本大学で開発された研究に基づいています37 。 潜在的な創始者を特定するためには、遺伝子タイピング戦略と配列決定技術が不可欠です。ランダム組込みの場合、ゲノムDNAの抽出は、Truett et al。 38 。このような迅速な抽出方法は、プライマーが導入遺伝子とハイブリダイズするように設計されているため、潜在的な創始者を同定するのに十分である（しばしば、複数のコピーとしてated）。逆に、遺伝子標的化は、PCR産物が改変されたゲノム領域を包含するので、高度に精製されたゲノムDNAを必要とする。 遺伝子ノックアウトのために、単一のsgRNAを注入する伝統的な方法は、小さな欠失（indels）または挿入を生成し、最終的に目的の遺伝子をノックアウトする。これらの小さな改変は同定が困難であり、これらの突然変異の性質を確認するために時間がかかるリガーゼ非依存性クローニングおよび配列決定をしばしば必要とする。 このプロトコールでは、目的の遺伝子の開始コドンを含む2つのsgRNAの系統的同時注入を開発するために、CRISPR多重化を利用した。これは、遺伝子ノックアウトの可能性を高めるばかりでなく、所定のサイズ（100〜300bp）のゲノムDNAの塊を切除して、簡単なPCRによって創始者を容易に同定することを可能にする。注目すべきは、期待されるゲノムeを保有していない子犬1つのsgRNAのみが活性であると証明されたとき、小さなフレームシフト突然変異についてxcisionを分析することができる。同様に、遺伝子編集の場合、細胞修復機構が優先的に2つの鎖39のうちの1つを使用するので、反対方向の2つの重複するsgRNAの体系的同時注入はHDRの効率を増加させるはずである。 将来のアプリケーション 現在のプロトコールは、ヒト発生条件の様々な洗練されたマウスモデルを生成するプロセスを単純化し合理化するために、マウス発生学および遺伝子標的化40の最新の進歩を利用する。これらのモデルは、最終的に治療戦略の開発を支援する、病理機構の理解を深めるのに役立ちます。遺伝子標的化またはランダム組込みに必要とされる試薬の最適化および合理化は、広くかつ容易に適用可能であるラット、ウサギのような他の哺乳動物種、さらにはウシのような大きな動物にさえも投与することができる。

脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。 今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった（2002）私（2003）。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル（受精から離乳までの6週間）、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色（交差戦略に必要）などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。特に、現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました3 。 遺伝子移入技術は、ウイルスの送達を用いて最初に作製された30年前の4年にわたる最初のトランスジェニックマウスの作製をもたらした4 。しかし、研究者はすぐに、マウスの遺伝子導入の主な課題の1つは、外因性DNAの運命を制御することができないことに気付いた。マウス卵母細胞へのトランスジーンのウイルス送達により、ゲノムに無作為に組み込まれた複数のコピーが得られたため、その後のトランスジェニック系統の樹立は限られていた。 このような制限の1つは、Gordon et al。マイクロインジェクション5,6で最初のトランスジェニックマウス系統を作製した。これは組換えDNA技術の時代を迎え、マイクロインジェクションセッションの成果に影響を及ぼすパラメータは広く研究されています7 。マイクロインジェクションは、導入遺伝子の組み込み部位（最終的に各創始マウスの特異的発現レベルをもたらす）の制御を可能にしないが、前核ミクロインジェクションの主な利点は、コンカテマー（ すなわち、トランスジーンの複数のコピーのアレイ、ゲノムインテグレーションの前に直列にリンクされている。この特徴は、関心のある遺伝子を過剰発現する何千ものトランスジェニックマウス系を確立するために長年にわたって用いられてきた。それ以来、遺伝子組み換えは、生物のゲノムの人工改変は、疾患の発生における単一の遺伝子の役割を同定するために広く用いられてきた。 Mario Capecchiが成功裏にマウスの単一の遺伝子を破壊し、遺伝子ターゲティングの時代を切り開いたときに、マウスゲノムを操作する上でのさらなる成果が達成されました8 。しかし、ES細胞の培養、キメラの程度の変化、およびプロセスの長さ（ すなわち、マウスを得るために最小12〜18ヶ月）を含む、ES細胞に基づく遺伝子標的化から急速に大きな欠点が浮かび上がった。 最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、および規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列（CRISPR / Cas9）のような工学エンドヌクレアーゼのような新技術の進歩が、マイクで遺伝子ターゲティングのプロセスを加速するe 9,10 。これらのエンドヌクレアーゼは、マイクロインジェクションによってマウス卵母細胞に容易に注射することができ、わずか6週間で遺伝子標的マウスを作製することができる。 ゲノム編集11のためのCRISPRの使用に関する最初の報告以来、この細菌適応免疫系は、合成の容易さおよび複数の座を一度に標的とする能力を含む多くの利点のために、ZFNおよびTALENに取って代わられた（「多重化&quot;）。 CRISPRは、マウス12の遺伝子標的化に初めて使用され、以来、植物からヒトへの無数の種に適用されている13,14 。現在までに、CRISPRゲノム編集に耐性のある単一種の報告はない。 トランスジェニックマウスの作製の2つの主要な制限段階は、卵母細胞の注入および再移植これらの卵母細胞を疑似妊娠した雌に分けた。この技術は我々 15およびその他16によって記載されているが、マウス発生学および遺伝子導入技術における最近の技術的改良は、遺伝子組み換えマウスの作製プロセスに革命をもたらした。これらの改良についてはここで説明する。

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1,000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Dilute to 1x</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free microinjection buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC microcentrifuge filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR expressing plasmid (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA purification spin columns (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donor plasmid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa embryo culture medium</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Glass microcapillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Vessel clamp</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Clips applier&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis set up</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulators</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Oocytes manipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Mice C57BL/6J strain</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

遺伝子改変マウスの使用は、生理学的および病理学的インビボプロセスの両方に関する研究に有意に寄与している 。受精卵母細胞へのDNA発現構築物の前核注入は、過剰発現のためのトランスジェニックマウスを生成するために最も一般的に使用される技術のままである。遺伝子標的化のためのCRISPR技術の導入により、受精した卵母細胞への前核注入は、ノックアウトマウスとノックインマウスの両方に拡大されている。この研究は、注射用DNAの調製と、遺伝子ターゲッティングのためのCRISPRガイドの作成について記述しており、特に品質管理を重視しています。潜在的な創始者の同定に必要な遺伝子型決定手順は重要である。本明細書では、CRISPRの「多重化」能力を利用する革新的な遺伝子型決定戦略を提示する。手術手順も概説されている。一緒に、プロトコルのステップは、世代の生成を可能にする免疫学、神経科学、癌、生理学、発達およびその他を含む多数の研究分野のためのマウスコロニーのその後の確立のために使用される。

以下に、ランダム組込みおよびCRISPR媒介遺伝子標的化の場合のマイクロインジェクションのワークフローを示す（ 図1 ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> 図1：遺伝的に改変されたマウスの典型的なワークフローランダム組み込みのために、精製されたトランスジーンは、卵管がプラグインされた雌の雌に移入される前に、受精卵母細胞の前核に注入される。後代の分析は、迅速なゲノムDNA抽出の後にPCRによって行う。 CRISPR遺伝子標的化のために、ここに記載された非クローニング法を用いてsgRNAを合成し、2つのガイドを受精卵母細胞の細胞質に同時注入する（Cas9 mRNAと共に）。この戦略は、その後のPCRに基づいて子孫を分析するために使用され、高度に精製されたgエノムDNA。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55765/55765fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 卵母細胞のマイクロインジェクションおよびこれらの注入された卵の再移植は技術的スキルとトレーニングを必要とする2つの主要な制限段階であるが、遺伝子組み換えマウスを首尾よく生成するためには注入混合物の品質が最も重要である。トランスジーン精製（ 図2A ）およびsgRNA合成（ 図3A ）の品質は、分析アガロースゲルで系統的に評価する必要があります。吸収の異なる値は、溶液の純度に直接依存するため、分光光度計で濃度を測定する場合は、ミックスの潜在的な汚染もチェックする必要があります（手順1.2.3,2.2.3.5、および2.2.5.3を参照）。 図2B ）および遺伝子ターゲティング（ 図3B ）の両方について、マイクロインジェクションセッションの典型的な読み出しを説明しています。 DNA抽出プロトコールは、実験の種類によっても異なる。その後のPCRは、導入遺伝子またはゲノムDNAのいずれかにそれぞれハイブリダイズするプライマーに依存する。ここに示した戦略は、遺伝子組み換えマウスの作製に必要な各ステップの簡単なトラブルシューティングと合理化を可能にします。 マイクロインジェクションセッションの定量結果は実験者の経験によって異なるが、プロトコールの各ステップが最適化されると、得られたトランスジェニック仔の​​割合は、典型的にはランダムインテグレーションのために10〜25％に達するはずである図2B （生まれた子15人のうち4人が26.6％）に示されているように、このやや「低い」効率は、マウスゲノムを編集するCRISPRコンポーネントの信頼できる能力とは対照的です。実際、遺伝子ターゲッティングのためにCRISPRを使用した場合、創始者の数は一般的に多く、25〜100％の範囲である（ 図3B参照 ; 13匹中3才= 23％）。 CRISPRを使用して編集したときに正常にホモ接合である子孫全体を得ることは珍しいことではありません。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig2.jpg" /> 図2：過剰発現のためのトランスジェニックマウスの成功した生産のための品質管理および遺伝子型決定戦略。 （ A ）プラスミドをPvuIおよびNotIで1時間消化する。完全な消化および正しいサイズ（ すなわち導入遺伝子= 7,338bp、バックボーン= 1,440+ 896 bp）を分析ゲル（1）でチェックする。分取ゲル（2）からのいくつかの消化産物の抽出は、導入遺伝子の濃度を増加させる。 UVへの長期間の曝露は避け、UVトランスイルミネーターの代わりに青色光を使用することを推奨します。 （B）ジェノタイピング戦略（1）：プライマーは導入遺伝子上に置かれ、200〜800bpの断片を生成するように設計されるべきである。遺伝子型決定を行う場合（2）、陽性対照（ すなわち、マイクロインジェクションに使用する注射ミックス）とネガティブコントロール（ すなわち、 WTマウスのゲノムDNA）を含めることが推奨されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55765/55765fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig3.jpg" /> 図3：品質管理とジェノタイピングStraGene-targeted（KO）マウスの成功した生産のために（ A ） インビトロ転写によって産生されたsgRNAの品質は、DNAテンプレートと生成された RNAを各ガイドについて平行して実行することによって評価される。 RNAのサイズはDNAよりわずかに大きい。品質が満足すべきものであれば（ すなわち、スミアバンドなし）、濃度が測定される。 （ B ）（1）エキソン1の開始コドンを包含する2つのガイド（反対方向）の設計。プライマーは、2つのガイドによって最終的に切除される領域の外側のゲノムDNAとハイブリダイズするように選択される。典型的には、この戦略は、PCR（2）を用いて異型接合（＃5および＃9）およびホモ接合（＃3）KO創始者を直接同定することを可能にする。ホモ接合動物のPCR産物は、WTバンドを示さない。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55765/55765fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <tablefo：keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo：keep-with-next.within-page = &quot;1&quot; <tbody><tr><td> 反応 </td><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td><td> 注意 </td></tr><tr><td rowspan="7">線状DNA鋳型の合成 （2.5） </td><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 97.2μL </td><td></td></tr><tr><td> 5×HF緩衝液</td><td> 36μL </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 9μL </td><td></td></tr><tr><td> 10mM dNTP </td><td> 9μL </td><td></td></tr><tr><td> 10μMfwdプライマー</td><td> 9μL </td><td> 5&#39;TTAATACGACTCACTATAGN 20 gttttagagctagaaatagcaagttaaaata aggctagtc 3 &#39; </td></tr><tr><td> 10μMrevプライマー</td><td> 9μL </td><td> 5&#39;AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3 &#39; </td></tr><tr><td> PrOof-Readingポリメラーゼ</td><td> 1.8μL </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> T7 RNA合成キットを用いたIVT （2.6） </td><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> XμL </td><td>総量20μLにする</td></tr><tr><td> NTPバッファミックス</td><td> 10μL </td><td></td></tr><tr><td>鋳型DNA </td><td> ≈300 ng </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td> 2μL </td><td></td></tr></tbody></table> 表1：本研究で使用した様々なマスターミックスの組成線状DNA鋳型の合成：T7プロモーターの最小配列（TTAATACGACTCACTATAG）は、20塩基対の配列の上流にある（ガイド; CRISPR設計ツールを用いて同定されたN20）および発現ベクターに相補的な配列（gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc）である。 試験管内で転写（IVT）：DNA鋳型の濃度に依存して、ヌクレアーゼを含まない水で最終体積を20μLに調整する必要があります。

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Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.5K ビュー.  University of New South Wales. マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。 

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

発生生物学

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

遺伝学

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

in vivoマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを用いた体細胞ゲノム改変マウスモデル

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

がん研究

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

<meta charset="utf8"></head><body>胚発生を研究するためのマウスラウンド精子細胞注入手順

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスラウンド精子細胞注射

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

マウスラウンド精子細胞注射

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

要約

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この動画の章

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

レンチウイルス媒介トランスジェニックマウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

in vivoマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを用いた体細胞ゲノム改変マウスモデル

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

要約

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loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

in vivoマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを用いた体細胞ゲノム改変マウスモデル

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

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レンチウイルス媒介トランスジェニックマウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法