Este protocolo se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de biología del desarrollo de los esófagos, lo que permite a los investigadores que no tienen acceso a microscopios de súper resolución producir imágenes de súper resolución. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores eludir el límite de difracción de la microscopía confocal convencional sin necesidad de un microscopio de superresolución mediante la expansión de la propia muestra. Este protocolo será beneficioso para aquellos que estudian cómo la localización de proteínas afecta la morfología o función celular en embriones intactos, particularmente cuando esas proteínas están organizadas en estructuras o redes subcelulares complejas.
El problema más común con el que se encuentran las personas es la pérdida de embriones a lo largo del protocolo. Es recomendable aplicar múltiples capas de Poli-L-Lisina para adherir los embriones firmemente. Después de los embriones, tome una base de placa de Petri de plástico de seis centímetros llena hasta la mitad con agar al 3%.
Marque un rectángulo de cinco por tres centímetros en el agar con una cuchilla de afeitar o un bisturí. Retire la losa de agar con una pequeña espátula de laboratorio. Luego invierta la base de la placa de Petri, colóquela en el banco y coloque la losa de agar encima de la placa invertida.
Retire la tapa de la placa de Petri y asegúrese de que esté seca. Con guantes, pegue un trozo de cinta adhesiva de doble cara en el interior de la tapa. Saque los viales que contienen los embriones recubiertos y fijados del agitador y colóquelos verticalmente en el banco de trabajo.
Deje que las fases orgánica y acuosa se separen. Los embriones correctamente fijados deben permanecer en su interfaz. Eliminar completamente la fase acuosa inferior con una pipeta Pasteur y una pipeta P200.
Utilice una pipeta Pasteur de vidrio equipada con una pera de látex para transferir los embriones fijados a una losa de agar en varios lotes pequeños para que no se adhieran al interior de la pipeta. Una vez que los embriones estén en la losa de agar, use una pipeta P200 para eliminar cualquier heptano restante cerca de los embriones. Ahora, deje caer la tapa de la cinta adhesiva de doble cara sobre la losa de agar desde una altura de dos centímetros para adherir los embriones a la cinta.
Retire suavemente la tapa de la losa de agar, colóquela boca abajo en el banco y agregue suficiente PBS Tween para cubrir los embriones en la tapa. Para recolectar los embriones deseados, use un microscopio de disección estereoscópica a un aumento de 100x con iluminación indirecta. Pinche la membrana vitelina cerca del extremo anterior o posterior del embrión con una aguja de vidrio fino para desinflarla y liberar la presión.
Use pinzas finas o una sonda de metal para empujar suavemente el embrión a través del orificio con la membrana vitelina aún adherida a la cinta adhesiva de doble cara. Deja los embriones no deseados en la cinta. Utilice periódicamente una pipeta Pasteur de vidrio para recoger cualquier embrión desvitellinizado flotante y trasladarlo a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros.
Prepare la solución de PDMS en un tubo cónico de 50 mililitros y cree un tubo equilibrado agregando una cantidad adecuada de agua a un segundo tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar la solución de PDMS a 500 G durante tres minutos a 15 grados centígrados. Luego viértelo en una placa de Petri de 10 centímetros a una profundidad de un milímetro.
Deje que la solución de PDMS se solidifique durante la noche a 55 grados Celsius. Una vez que la losa de PDMS esté solidificada, marque áreas cuadradas ligeramente más pequeñas que un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros con un bisturí. Dentro de cada cuadrado, marca y retira un hueco cuadrado de ocho milímetros de ancho.
transfiera cada pocillo cuadrado de PDMS a un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros y adhiéralo firmemente. Para adherir los embriones a los cubreobjetos, aplique suficiente 0,1% de poli-L-lisina para cubrir la superficie del cubreobjetos dentro de cada pocillo y colóquelos en una incubadora a 55 grados centígrados para que se sequen. Enjuague brevemente los embriones y el PBS para eliminar el detergente Tween.
A continuación, transfiera más de 10 embriones a cada pocillo recubierto de poli-L-lisina. Deje que los embriones se asienten en el fondo de los pocillos. Retirar el exceso de líquido de los embriones adheridos con una pipeta Pasteur e inmediatamente proceder al siguiente paso.
Mientras los embriones permanecen en la solución de monómero, prepare una solución de gelificación para cubrir los pocillos de PDMS. Diluya el oxidante catalítico recién extraído del polvo. Combine 3.920 microlitros de solución de monómero con 60 microlitros de TEMED al 10% y 20 microlitros de TEMPO al 1%.
Divida la solución de gelificación en alícuotas de 125 microlitros en múltiples tubos de PCR. Retire la solución de monómero de los pocillos de PDMS con una aspiradora o pipeta teniendo cuidado de no alterar los embriones. Agregue cinco microlitros de APS a uno de los tubos de PCR que contienen la solución de gelificación para iniciar la polimerización.
Distribuya rápidamente la solución de gelificación polimerizante entre los tres pocillos. Repita esto hasta que todos los pocillos y embriones estén cubiertos. Deje que las muestras se gelifiquen durante 1,5 a 2,5 horas a 37 grados centígrados.
Los hidrogeles más gruesos tardarán más en completar la polimerización y solidificarse. Agite los hidrogeles con frecuencia para controlar la polimerización. Una vez solidificados, los hidrogeles no se moverán.
Después de la gelificación, retire los pocillos de PDMS del cubreobjetos sin alterar los hidrogeles. Transfiera los hidrogeles individualmente a los pocillos de una placa de seis pocillos. Los hidrogeles pueden expandirse ligeramente durante la digestión.
Cubra los geles completamente con tampón de digestión. 30 mililitros de tampón de digestión son suficientes para cubrirlos en una placa de seis pocillos e incubarlos durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la digestión, mueva los hidrogeles a una placa de Petri de seis centímetros y llénela con agua desionizada para que se expanda.
Los hidrogeles pueden desprenderse de los cubreobjetos en este punto y expandirse cuatro pliegues en dimensión lineal. Con una pipeta Pasteur, elimine la mayor cantidad posible de agua de la placa de Petri para minimizar el movimiento de los geles cuando se manipulen. Maniobre los geles expandidos con los embriones en la superficie inferior sobre un cubreobjetos grande para obtener imágenes.
Monte cada cubreobjetos con gel sobre el objetivo de un microscopio confocal de barrido láser invertido. Después de ubicar las muestras correctamente organizadas y orientadas, se cambió a un objetivo de inmersión en aceite o agua de gran aumento para obtener imágenes en alta resolución. La medición de la longitud del embrión a lo largo del eje de la cabeza a la cola bajo un objetivo de 10x mostró que los embriones no expandidos abarcaban aproximadamente la mitad de un campo de visión, mientras que los embriones expandidos abarcaban aproximadamente dos campos de visión completos.
La longitud media de la cabeza a la cola de los embriones de control no expandidos fue de 398,8 micrómetros. Para los experimentos uno, dos y tres, las longitudes medias de los embriones fueron factores de expansión de 4,0 veces, 4,7 veces y 4,9 veces, respectivamente. En la muestra control, las células del segmento maxilar tenían un ancho promedio de 4,76 micrómetros.
En las muestras expandidas, las células del segmento maxilar tenían un ancho promedio de 19,10 micrómetros, lo que representa una expansión de 4,0 veces. El citoesqueleto de actomiosina se visualizó en el control no expandido frente a los embriones expandidos, sometidos a extensión convergente. Aparecieron como una sola línea donde se reunían las células vecinas.
Por el contrario, en embriones expandidos en etapa siete, se pudieron observar líneas paralelas de miosina dos en las uniones celulares, que representan grupos de proteínas corticales en células adyacentes. En los embriones no expandidos de la etapa seis, las mitocondrias marcadas con estreptavidina aparecieron como una neblina citoplasmática heterogénea sin detalles subcelulares claros. Sin embargo, en los embriones expandidos, numerosos puntos fueron resolubles dentro del citoplasma, probablemente representando mitocondrias fragmentadas o porciones de la red mitocondrial.
Una cosa importante que hay que recordar al intentar este procedimiento es proteger los embriones de la exposición excesiva a la luz después de la incubación secundaria de anticuerpos.
