Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Preparación del soporte para placas de 96 pocillos <ol><li> Crear un mapa de la placa de 96 pocillos delineando los diferentes sustratos y tipos de células para ser examinado (Figura 1). </li><li> Obtener las soluciones madre de diferentes sustratos [poli-L-lisina, fibronectina, colágeno tipo I, laminina y colágeno IV-entactina-laminina (ECL)], una placa de 96 pocillos de pocillos múltiples y preparo una estación de trabajo en un cultivo celular estéril capucha. </li><li> Preparar sustratos individuales por dilución de valores en salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a una concentración final de 5 mg / ml (esta concentración se determinó previamente sobre la base de un ensayo dependiente de la concentración de sustrato para el crecimiento y la proliferación de las células). Mezclar utilizando un vórtice antes de verter en un depósito estéril. </li><li> Añadir 100 l de solución de sustrato en cada pocillo de acuerdo con el mapa de 96 pocillos (Figura 1) (una micropipeta de 12 o de 8 canales es conveniente para micropipeteado en una placa de 96 pocillos). Sellar la tapa a la placa de 96 pocillos usando una tira de Parafilm y almacenar durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 2. célula de recubrimiento y Time-lapse de imágenes NOTA: Mouse MSCs fueron aisladas de la médula ósea de adultos C57BL / 6 ratones y se mantiene como una línea de células adherentes. MSCs se infectaron usando vectores lentivirales para diseñar ellos para secretar-cerebro factor neurotrófico derivado (BDNF; cDNA humano) y derivado de células gliales factor neurotrófico (GDNF; ADNc humano) usando la codificación BDNF (LV-BDNF de vector lentiviral; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), y la proteína verde fluorescente (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). NOTA: Los medios de cultivo para las células madre mesenquimales de ratón (MSC) es medio de Dulbecco modificado de Iscove que contiene 10% de suero de hibridoma cualificado fetal bovino, 10% de suero equino, 2 mM L-glutamina, y 10.000 U / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina . Los cinco tipos diferentes de MSC de ratón (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC y BDNF GDNF-GFP-MSC) se sembraron a alrededor del 30% de confluencia en frascos de cultivo celular T75 /. <ol><li> Célula de recubrimiento <ol><li> Al día siguiente, eliminar las soluciones de sustrato por aspiración y enjuagar cada pocillo con aproximadamente 200 l de PBS estéril, dos veces. Añadir medio de cultivo celular (200 l / pocillo) a cada pocillo después del enjuague final PBS. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular fijado en 37 ° C y 5% de CO 2 para el equilibrado. </li><li> Mientras que la placa de 96 pocillos se equilibradores en la incubadora, recoger las células (MSCs en matraces T75 deben ser aproximadamente 70% confluentes en el momento de la cosecha / chapado) mediante la recopilación de los medios de crecimiento (se hace referencia a medios de comunicación como condicionada) del matraz T75 y almacenar en un tubo cónico de 15 ml en condiciones estériles (este medio acondicionado se utilizará en el paso 2.1.4 a continuación). </li><li> Añadir 8 ml de PBS estéril al matraz y agitar suavemente y luego la pipeta de la PBS y añadir 1 ml de tripsina al 0,05% y 0,01%Solución de EDTA para separar las células de la superficie de cultivo del matraz T75. Monitorear el desprendimiento de células mediante la visualización del matraz usando un microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase. </li><li> Cuando las células han individual, añadir inmediatamente 8 ml de medio condicionado (recogidos en el paso 2.1.2) al matraz. Recoger la suspensión celular y transferir a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml y centrifugar durante 4 min a 450 xg para sedimentar las células. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 200 l de fresco y calentado (37 ° C) medios de cultivo celular. </li><li> Determinar el número de células en la suspensión celular mediante la realización de un recuento de células viables azul de tripano usando un hemocitómetro. Placa de las células a una densidad de aproximadamente 300 células / pocillo en los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos. </li><li> Repita estos pasos para cada población de células. </li></ol></li><li> Time-lapse <ol><li> Una vez que todos los MSCs se han plateado, lugarla placa de 96 pocillos en una incubadora durante 2 horas para permitir que las MSC para unir al sustrato. </li><li> Inicie el sistema HCS y esperar 2 horas para que el sistema se equilibre. Ajuste el controlador ambiental a 37 ° C y conectar un cilindro de gas mixto que contiene 5% de CO2 en aire para el sistema de cámara ambiental HCS el suministro de una fuente de aire constante. </li><li> Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora después del periodo de equilibración 2 hr y colocar directamente en la cámara de crecimiento celular del sistema de HCS. Permita 30 minutos para el equilibrio para dar cuenta de cualquier expansión relacionadas con el calor de la placa y luego iniciar la adquisición y análisis de imágenes de software para configurar los ajustes de la placa. </li><li> Seleccionar el objetivo 20X para formación de imágenes. Seleccione dos pozos por condición [es decir, las buenas prácticas agrarias-MSC en fibronectina etc. (6 sustratos x 5 subtipos MSC para un total de 30 condiciones x 2 repeticiones = 60 pozos en total)] para la creación de time-lapse. Elija dos sitios para la formación de imágenes conen cada pocillo. </li><li> Elija las longitudes de onda de luz correctas para imágenes. NOTA: Hay dos longitudes de onda diferentes (contraste de fase y fluorescencia GFP) fueron seleccionados para time-lapse. </li><li> Enfoque en el fondo del pozo con el autofoco láser y tomar imágenes de prueba para múltiples sitios y múltiples pozos para encontrar un plano focal optimizado. </li><li> Una vez que el enfoque se ha establecido, comenzar a capturar imágenes cada 5 minutos durante 48 horas para todos los 60 pozos (120 sitios). </li><li> Alimentar a las células cada 24 horas mediante la eliminación de la placa de 96 pozos del sistema de HCS. Retire 75 l de los medios de comunicación de cada pocillo y añadir 100 l de medio fresco a cada pocillo (equilibrar este medio fresco a 37 ° C y 5% de CO 2). </li><li> Al final del experimento de lapso de tiempo, retire la placa de 96 pozos del sistema de HCS. En condiciones estériles, recoger las muestras de medio condicionado de cada pocillo y transferir estas muestras a otra placa de 96 pocillos. NOTA: Estas muestras pueden ser utilizados para más analyses mediante la realización de ELISA para los factores neurotróficos. </li><li> Preparar la placa de 96 pocillos con MSCs cultivadas para ensayos adicionales, tales como ensayo de proliferación celular Ki67 o yoduro de propidio ensayo de tinción en vivo / muerto (ver detalles a continuación). </li><li> Realizar análisis de time-lapse de células de seguimiento migración / celular como se describe en la sección 5. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 Proliferación Celular y yoduro de propidio Live / Dead Ensayo <ol><li> Ensayo de proliferación Ki67 celular (inmunocitoquímica) <ol><li> Enjuagar los cultivos de células con 0,1 M de fosfato (PO 4) tampón durante un minuto dos veces. Fijar el cultivo con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente. Retire la PFA y enjuagar los pocillos con PBS durante siete minutos, tres veces. </li><li> Después del enjuague final, añadir 100 l de solución bloqueante (tampón fosfato salino, 5% de suero normal de burro, 0,4% de suero de albúmina bovina, y 0,2% de Triton X-100) a cada pocillo de unand incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Preparar el anticuerpo primario, conejo anti-Ki67, mediante la dilución en solución bloqueante en una relación de trabajo de 1: 200. </li><li> Eliminar la solución y aplicar bloqueador 100 l de la solución de anticuerpo primario a cada pocillo. Cubrir la placa de 96 pocillos e incubar las muestras a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, eliminar la solución de anticuerpo y enjuagar con PBS durante 7 min, 3 veces. </li><li> Preparar el anticuerpo secundario, burro anti-conejo Cy3 en solución de bloqueo a una relación de trabajo de 1: 500. Añadir tinción nuclear DAPI a la solución de anticuerpo secundario a una dilución de 1: 100. Después de la eliminación del último aclarado PBS, aplicar 100 l de la solución de anticuerpo / DAPI secundario a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo / DAPI secundaria y enjuagar cada pocillo con PBS durante 7 minutos, 3 veces. Cubrir la placa de 96 pocillos y se almacena a 4 ° C hasta su imagen. </li></ol></li><li> Propidium yoduro Live / Dead Ensayo <ol><li> Medir la muerte celular por yoduro de propidio (PI) ensayo de exclusión como se describe a continuación. </li><li> Preparar la solución de tinción de yoduro de propidio a una concentración de 1,5 mM en medio de cultivo. </li><li> Añadir 100 l de etanol al 70% a un pocillo de la MSCs durante 2 min con la intención de matar a esas células. Esto bien sirve como un control positivo para la tinción PI. La mayoría de las MSC será PI-manchado que indica la muerte celular. Eliminar la solución de etanol. </li><li> Añadir 100 l de solución de tinción de yoduro de propidio a cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 ° C en un incubador de CO2 5%. </li><li> Enjuagar las células con tampón fosfato 0,1 M durante 1 min, 2 veces. Fijar las células con PFA al 4% en tampón 0,1 M P0 4 durante 20 min a temperatura ambiente. Retire la PFA y enjuagar con PBS tres veces durante 7 minutos. </li><li> Incubar con una solución de DAPI (01:50) diluido en solución bloqueante durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague todos los pozos conPBS durante 7 min, 3 veces. </li><li> Eliminar la solución de DAPI y enjuagar cada pocillo con PBS durante 7 minutos, 3 veces. Cubrir la placa de 96 pocillos y se almacena a 4 ° C hasta su imagen. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Automatización de Imágenes y Multiwavelength Scoring <ol><li> Cargue una placa de 96 pocillos (previamente procesada para immunolabeling Ki67 o yoduro de propidio manchadas) en el sistema de HCS y permita que la placa se equilibre durante 20 min Abra la adquisición y análisis de imagen sistema de software HCS. </li><li> Seleccione los valores de adquisición para el objetivo de 10X usando la cámara se va a agrupar en 1 y un ajuste de ganancia de 2. Busque el Z-plano en el que residen las células mediante la utilización de la función de exposición automática y calcular el desplazamiento para cada longitud de onda de interés. Para este análisis, imágenes de la captura de DAPI (W1), Cy3 (W2) y FITC (W3). Elija el nivel de intensidad máxima a la que los pocillos de control negativo no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Confirmar este ajuste es apropiado para la pospozos sitivos. </li><li> Adquirir plato. Captura imágenes y almacenarlas en la adquisición de imágenes y base de datos de software de análisis. </li><li> Una vez que las imágenes han sido adquiridas, imagen abierta adquisición y análisis de software fuera de línea y placa revisión de los datos de las imágenes adquiridas anteriormente. </li><li> Seleccione el análisis de puntuación Multi-longitud de onda. Configurar la intensidad mínima y máxima para cada longitud de onda. NOTA: detección DAPI debe marcar la coloración alrededor de cada núcleo visible. Cy3 debe detectar las células Ki67 positivas con inmunorreactividad (IR) y no debería detectar IR bajo los controles negativos. Para Cy3 Ki67 IR, el ancho mínimo aproximado fue de 7 m, ancho máximo aproximado fue de 30 m, la intensidad por encima del fondo local era 150 niveles de gris, y la zona manchada mínimo era de 50 m 2. </li><li> Ejecutar análisis para todas las posiciones. Exportar los datos para ver en hoja de cálculo. </li></ol> Seguimiento 5. celular <ol><li> Acquisitio Abrir imagenn y el programa de análisis y haga clic en &quot;Revisión de la placa de datos [DB] ...&quot;, la selección de la placa de interés. </li><li> Ver los datos como &quot;Tiempo vs. Bueno&quot;. </li><li> Elija uno de los sitios de la sección &quot;Sitios&quot; haciendo clic izquierdo en la selección deseada. Seleccione &quot;Transmitido ...&quot; en el capítulo &quot;Las longitudes de onda:&quot;. Haga clic derecho sobre la meta bien en la plantilla de la placa de 96 pocillos y haga clic en &quot;Cargar imágenes&quot;. </li><li> Seguimiento de las células haciendo clic en &quot;Aplicaciones&quot; y luego en &quot;Objetos de pista&quot;. </li><li> Utilice &quot;intercambio dinámico de datos (DDE)&quot; para elegir el formato para exportar los datos, por ejemplo, Microsoft Excel. </li><li> Elija los datos de seguimiento a la exportación, por ejemplo, el tiempo transcurrido, el número de objetos, la distancia, el intervalo de tiempo, velocidad, ángulo absoluto, distancia al origen, delta X y delta y. </li><li> Tag cada célula de interés con &quot;Ctrl + clic izquierdo&quot; en las células diana. </li><li> Células de pista. Si es necesario, detener / cambiar seguimiento inadecuado de las células con la tecla &quot;Esc&quot; y luego ajustar la configuración. </li><li> Después de rastreo celular es completa, guardar los datos con &quot;Registro de datos&quot;. </li></ol>

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Células madre adultas mesenquimales (MSCs) son un tipo de célula atractivo para el desarrollo de una estrategia experimental que combina una terapia basada en la entrega celular y génica. MSCs son multipotentes, capaces de diferenciarse en células de linaje mesodérmico, y muestran considerable plasticidad, diferenciando / transdifferentiating en linajes neuronales y gliales con la inducción apropiada paradigmas 17,18. Además, las MSC se han trasplantado y demostrado su eficacia en estudios preclínicos para una serie de trastornos, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 19. La eficacia terapéutica de MSCs es bien conocido debido a sus anti-proliferativos beneficioso, actividades anti-inflamatorias y anti-apoptóticos 20. MSCs son también conocidos para producir y secretar diversos factores neurotróficos y de crecimiento, que probablemente contribuye a las cualidades neuroprotectoras asociados con MSCs ingenuos después del trasplante en los sitios de lesión o enfermedad 21. Importantly, MSCs se pueden modificar genéticamente para la entrega sostenida de factores neurotróficos para aplicaciones de terapias de gen celular y combinados y se han utilizado en un número de modelos animales de lesión o la enfermedad del CNS 11,19,22. En el desarrollo de una estrategia basada en la terapia celular y génica combinada, es importante que la salud de las células se evalúa cuidadosamente antes de su uso extensivo en vitro, y especialmente en aplicaciones in vivo. Como una prueba de concepto, que investigó múltiples poblaciones de líneas de ingeniería y MSC de control con el fin de estudiar las consecuencias de las modificaciones genéticas en la salud celular y fitness utilizando un enfoque de alto contenido de screening (HCS). En general, HCS se refiere a la selección de alto rendimiento basado en imágenes celular 14. Este enfoque de detección permite una evaluación cuantitativa de fenotipos celulares en múltiples niveles de espacial (celulares para subcelular) y temporales (milisegundos al día) resolución a través de diversas condiciones experimentales. Usando este enfoque accedimos posibles diferencias en la preferencia de sustrato sobre los siguientes parámetros: proliferación celular, la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP), la muerte celular, la motilidad celular y / migración. Los experimentos fueron diseñados en formato de 96 pocillos placa de cultivo celular. Dentro de una sola placa se determinó rutinariamente posibles diferencias relacionadas con el sustrato con respecto a cada parámetro para las diferentes poblaciones de células MSC lentiviral transducidas y se compararon los MSCs de ingeniería con el original, MSC no transducidas. Esto proporcionó un medio para comparar directamente los resultados para los diferentes subtipos de MSC con una batería de ensayos in vitro tales como la proliferación celular utilizando immunolabeling Ki67, ensayo de viabilidad de células vivas / muertas mediante la tinción de yoduro de propidio, y el comportamiento celular mediante la realización de imágenes digitales en tiempo lapso . Como una extensión de esta HCS también se puede llevar a cabo pruebas ELISA en muestras de medios condicionados recogidos de individuo wells para determinar cuantitativamente la secreción de factores neurotróficos. El medio condicionado a partir de diferentes subtipos MSC también se puede utilizar en bioensayos in vitro para determinar la actividad biológica de factores secretados 11,23. Este tipo de plataforma de HCS también se puede utilizar para mediciones in vitro del crecimiento de neuritas a partir de cultivos neuronales primarios y líneas de células madre neurales 24. En general, nuestros resultados demostraron que las subpoblaciones de las MSCs genéticamente modificados muestran comportamientos similares en comparación con los MSCs no modificados. La influencia de diversos sustratos de cultivo sobre el crecimiento celular y la migración celular no fue dramáticamente diferente entre los subtipos de MSC, así como sustratos de cultivo. Como tal, los sustratos de matriz extracelular probados no parecen jugar un papel crítico en la modulación de estos aspectos de comportamiento de las células para estas diferentes MSCs de ingeniería. Este estudio demuestra el uso de un sistema de HCS para analizar different aspectos del comportamiento celular. Sin embargo, no es raro encontrar limitaciones asociadas con análisis de imagen. En ocasiones, al analizar las imágenes de fluorescencia, que era un poco difícil determinar el valor umbral por encima del cual correcta immunolabeled o células teñidas se contarían como positivamente marcado / manchado. Por lo tanto, para minimizar el sesgo subjetiva, la determinación de los valores umbral era dependiente de una comparación con los controles (controles negativos para imágenes de fluorescencia se llevaron a cabo en paralelo durante todo el procesamiento por la omisión de los anticuerpos primarios o secundarios). Se encontró Otra limitación durante el análisis de la migración celular utilizando la imagen digital de lapsos de tiempo. En algunos casos, el software de imagen no era capaz de diferenciar entre el movimiento browniano aleatorio de una célula frente a la migración de una célula en realidad sólo una distancia muy corta. Las limitaciones adicionales fueron evidentes en situaciones donde el software de análisis no era capaz de distinguir la presencia de multipcélulas LE en una proximidad muy cercana a uno-otro. Para superar esta limitación se requiere la selección manual de células durante el análisis en lugar de un análisis totalmente automatizado. Densidad de placas de la célula también puede resultar en sesgando los datos de migración celular entre poblaciones de células que muestran mayor preferencia para crecer en grupos frente a las células que crecen en aislados unos de otros. Estos tipos de diferencias son, en parte, probablemente un reflejo de la célula-sustrato frente a las preferencias de célula-célula. El uso de un sistema de HCS para adquirir imágenes y realizar análisis de datos proporciona un medio eficaz y rápidos para evaluar múltiples parámetros de la celda. Además, los vídeos digitales de lapso de tiempo de 30 condiciones diferentes (6 sustratos y 5 subtipos diferentes MSC) fueron adquiridos de forma rutinaria por períodos que van de horas a días (48 horas), mientras que el uso de la cámara ambiental. Posteriormente, estos datos se utilizó para calcular y determinar las diferencias en las tasas de migración celular a través de varias líneas celulares de diferente ECMmoléculas. En este informe hemos destacado la implementación de una plataforma de filtrado de contenido para evaluar la salud y la función celular. Este tipo de análisis es útil para el desarrollo de estrategias racionales para el diseño de tipos de células, así como sustratos de polímero para facilitar el crecimiento de células dirigida y la regeneración neural. Este es un paso esencial hacia la aplicación de entrega basada en células madre de factores terapéuticos antes de su extensa en los estudios preclínicos in vivo utilizando estrategias de trasplante celular.

Un problema importante con la implementación de terapias útiles para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso se encuentra en el desarrollo de métodos eficaces que previenen la degeneración y también facilitan la recuperación de la función. Una estrategia innovadora es la modificación genética de células madre ingeniero ex vivo, para la producción de factores neuroprotectores, antes de su trasplante. Esta combinación de terapia basada en células, junto con un tipo de terapia de genes, proporciona un método potente para el tratamiento de la enfermedad o la muerte neuronal inducida por la lesión en el sistema nervioso. Los factores neurotróficos son esenciales para el crecimiento y la supervivencia de las neuronas en desarrollo, así como el mantenimiento y la plasticidad de las neuronas maduras. Un número de estudios han demostrado papeles significativos de factores neurotróficos en la promoción de crecimiento inicial y la diferenciación de las neuronas en el sistema nervioso central y periférico (SNC y SNP) y también puede estimular la regeneración in vitro y en unaNimal modelos de lesión neural 1. Cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF) es altamente expresado en el sistema nervioso central y desempeña un papel importante en la regulación del desarrollo neural, la plasticidad sináptica y la reparación 2. Derivado de la línea celular glial factor neurotrófico (GDNF) promueve la supervivencia de muchos tipos de neuronas incluyendo neuronas motoras dopaminérgicas y 3. Por lo tanto, una estrategia importante para la reparación neural es proporcionar fuentes exógenas de factores neurotróficos a las regiones lesionadas o enfermas del sistema nervioso. Las células derivadas de la médula ósea Multipotentes madre mesenquimales (MSC) tienen un gran potencial para la entrega de proteínas terapéuticas para tratar el sistema nervioso dañado o enfermo. El trasplante de MSCs ha atraído considerable atención en los esfuerzos para desarrollar terapias basadas en células compatibles paciente, ya que tienen un número de ventajas incluyendo, 1) relativa facilidad de aislamiento y mantenimiento, 2) capacidad multipotenciales, 3) pequeñas preocupaciones éticas, 4) Capacidad de sobrevivir y migrar después del trasplante y 5) el potencial para el trasplante autólogo de 4,5. Resultados prometedores se han reportado con el uso de MSC no tratados previamente y de ingeniería genética en modelos animales para un número de diferentes condiciones neurodegenerativas, incluyendo la lesión de la médula espinal 6,7, 8,9 accidente cerebrovascular, la deficiencia de mielina 10, y degeneración de la retina 11-13. El acoplamiento de trasplante de células con la entrega de factores neurotróficos partir de células madre genéticamente modificadas es una importante estrategia de reparación neural novedoso y. Un paso esencial en el desarrollo de sistemas de administración de factor terapéutico a base de células es determinar la salud normal de las células manipuladas. Como tal, el objetivo principal de este estudio fue evaluar los parámetros de crecimiento general de las células madre adultas genéticamente modificados. Un enfoque importante para evaluar rápidamente múltiples parámetros de la celda es emplear celular de alta a través screenin basado en imágenesg (HTS), se refirió a los procedimientos de tan alta de detección de contenido (HCS) 14 veces. Esta tecnología permite la adquisición de imágenes y análisis automatizado y este enfoque es especialmente adecuado para aplicaciones de investigación de células madre. En este proyecto hemos desarrollado una plataforma de perfiles que permite la caracterización rápida y optimización de las preferencias de sustrato celular y funciones celulares con células madre adultas de ingeniería genética que emplea un sistema de HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Los parámetros de crecimiento de MSC fueron examinados por el cultivo de las diferentes poblaciones de MSC sobre diferentes sustratos. Las cinco poblaciones diferentes de subtipos MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, y BDNF / GDNF-GFP-MSC) se sembraron en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos pre-revestidas con el diferente sustratos como se ilustra en la Figura 1. Después de cuatro días de cultivo, las placas se fijaron y immunolabeled y / o teñidas con los reactivos apropiados y luego examinadas utilizando el sistema de HCS y análisis realizados con la adquisición de la imagen y el programa de software de análisis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1:. Plantilla de la placa de 96 pocillos para el diseño experimental placas de 96 pocillos se recubrieron con varios sustratos y los pocillos se sembró con células madre Engineered como se muestra en la plantilla. Como un ejemplo, sólo wells en filas BF se utilizaron en este experimento. Filas A, G y H se quedaron vacíos. Abreviaciones - MSC: células madre mesenquimales; GFP-MSC: verde fluorescentes MSC que expresan la proteína; BDNF-GFP-MSC: derivado del cerebro MSC factor que expresan GFP neurotróficos; GDNF-GFP-MSC; Derivado de células gliales MSC factor que expresan GFP neurotróficos; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF y GDNF MSC expresan GFP; ECL: entactina-colágeno IV-laminina). Immunolabeling anti-Ki67, seguido de contratinción DAPI, se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influenciados proliferación de las diferentes poblaciones de MSCs de ingeniería (Figura 2a). Expresión del antígeno Ki67 se produce preferentemente durante las fases finales de G 1, S, G 2 y M del ciclo celular, y no se detecta en las células en la fase de reposo (G 0), y por lo tanto es útil como un marcador para la proliferación celular 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es un nu comúnmente utilizadocounterstain clara y el cromosoma que emite fluorescencia azul tras la unión a AT regiones de ADN 16. El número total de células en un campo puede determinarse contando el número de núcleos teñidos con DAPI. Como se ilustra en la Figura 2B, aunque hubo una variación en los porcentajes de MSCs en proliferación, todos los sustratos, sin embargo, el apoyo considerable proliferación celular para cada uno de los subtipos de MSC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: ensayo de proliferación celular Ki67. (A) Fusionada, imagen doble fluorescente de Ki67 immunolabeling (rojo) y DAPI (azul) tinción nuclear. Muchos de los MSCs se immunolabeled con el anticuerpo Ki67 (rojo). Barra de escala = 50 m. (B) Gráfico de barras que ilustra los porcentajes de Ki67 immunolabeled subtipos de MSC cultivadas en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágenoTipo I, laminina, colágeno o entactina-IV-laminina (ECL) sustratos para 5 días in vitro (DIV). N = un experimento. Cada barra representa un promedio de los datos agrupados de 8 sitios fotografiados de 2 pozos para cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Yoduro (PI) tinción de propidio se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influenciados supervivencia celular (Figura 3). El yoduro de propidio es un contratinción nuclear y el cromosoma-rojo fluorescente de uso común. El yoduro de propidio es impermeable a la membrana y generalmente excluido de células viables, y por lo tanto es útil para detectar las células muertas en una población. La proporción de células muertas dentro de una condición dada se puede determinar cuando se combina con una etiqueta nuclear general tal como DAPI para identificar todas las células dentro de un campo. El porcentaje de células PI-positivo era bajo en todos los sustratos examinados (La Figura 3). Como control positivo para el reactivo de PI, a unos pocillos que contienen MSCs se incubaron en 70% de etanol, una condición conocida para matar la mayoría de las células, lo que resulta en un alto porcentaje de células PI-etiquetados como se ilustra en la Figura 3B y 3C (etanol tratada positivo control). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: ensayo de la muerte celular yoduro de propidio. (A) Fusionada, doble imagen fluorescente de yoduro de propidio (rojo) y DAPI (azul) tinción. Aunque los núcleos de todas las células viables se tiñeron con DAPI (azul), no se detectó tinción con yoduro de propidio en el MSC. (B) Prácticamente todos los MSCs se tiñeron con yoduro de propidio después de la exposición a etanol al 70%. Las barras de escala en A y B = 100 m. (C) Gráfico de barras que ilustra los porcentajes de yoduro de propidio (PI) manchada subtipo MSCs crecido en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágeno tipo I, laminina, colágeno o entactina-IV-laminina (ECL) sustratos para 5 días in vitro (DIV). Control de etanol: Esta condición sirvió como control positivo para el reactivo de tinción PI. La mayoría de las células sometidas a tinción PI tras el tratamiento de etanol están muertos y por lo tanto manchadas positivamente para el reactivo PI. N = un experimento. Cada barra representa un promedio de los datos agrupados de 8 sitios fotografiados de 2 pozos para cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para investigar la posible influencia de los diferentes sustratos en el comportamiento de las MSC de ingeniería, la migración celular se analizó mediante microscopía digital en tiempo transcurrido y el sistema de transmisión de luz / ambiental cámara en el sistema HCS (ver Suplementario Video 1). Múltiples sitios / pocillo fueron imágenes de lapso de tiempoy se utiliza para calcular las tasas de migración celular para las diferentes subpoblaciones de MSC que crecen en los diferentes sustratos utilizando el programa de software de adquisición y análisis de imágenes. En general, como se muestra en la Figura 4C, todos los subtipos de MSC mostraron la tasa de migración más rápida en las superficies de la matriz extracelular (fibronectina recubiertos, colágeno, laminina y ECL) y el más lento en las superficies no revestidas de poliestireno. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. De seguimiento de la célula y la migración MSC rastreados con adquisición de imágenes y software de análisis. Imágenes superpuestas de luz y fluorescencia de transmisión de imágenes (A) el inicio de time-lapse y (B) en 29 horas más tarde al final de la sesión de time-lapse (ver Suplementario Video 1). Pistas de migración celular se indican con el li colornes. Barra de escala:. 50 micras gráfico (C) de barras que ilustra las tasas de migración media (expresada como m / h) para los subtipos de MSC cultivadas en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágeno tipo I, laminina, o entactina-colágeno IV-laminina (ECL) sustratos para 2 días in vitro (DIV). N = un experimento. Cada barra representa la media de al menos 10 células fotografiados de 2 pozos para cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan evidencia preliminar de que estas subpoblaciones de MSCs genéticamente modificados presentan propiedades de crecimiento similares. Estos resultados proporcionan evidencia convincente de que la lentiviral mediada modificaciones genéticas de estos MSC inducidos sin efectos deletéreos detectables dramáticos sobre los parámetros de crecimiento investigados utilizando esta plataforma de cribado. Suplementario vídeo 1. Time-lapse vídeo digital de MSC seguimiento utilizando el programa de software de adquisición y análisis de imágenes. La ruta de migración es para dos MSC [indicadas como 1 (línea de rastreo verde) y 2 (línea de rastreo azul)] se ilustran. Vídeo capturado durante un período de 29 horas. Las imágenes fueron capturadas cada 5 min. Las imágenes de fluorescencia de MSC que expresan GFP se utilizó para time-lapse en la elaboración del video. La barra de calibración = 50 micras. Este tipo de análisis es útil para la investigación de comportamientos celulares, incluyendo la migración celular y la división celular.

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

high-throughput-characterization-adult-stem-cells-engineered-for

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K vistas.  Iowa State University. This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Video: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Investigación

Medicina

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Trasplante de células madre de Estrategias para la restauración de la disfunción cognitiva causada por la radioterapia craneal

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Ratón enucleación del ojo por remoto de alto rendimiento fenotipificación

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

Alto rendimiento secuencial ELISA para la Validación de Biomarcadores de aguda injerto contra huésped

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Entrega intranasal de células madre terapéuticas a glioblastoma en un modelo de ratón

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...