Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Investigación de Ingeniería del Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 a William G. Bendena.

1. Preparación de organismos experimentales <ol><li> Elija 10 L4 de nematodos por cepa 24 h antes de comenzar el ensayo para asegurar que los organismos son adultos jóvenes cuando se prueban. Para cada nematodo mutante o de control ensayado, se seleccionan 10 L4s (10 para el testigo y 10 para el ensayo). <ol><li> Mantener los organismos L4 utilizando métodos estándar 26 , 27 durante 24 h en placas de agar estándar sembradas con OP50 Escherichia coli . Si se pierden organismos durante las etapas de lavado subsiguientes, compensar aumentando el tamaño de la muestra inicial ( es decir, recoger 20 gusanos en lugar de 10). Nota: El comportamiento es un fenotipo innatamente variable. Realizar el método por triplicado para cada cepa en tres días distintos. Incluir cepas de control adicionales y condiciones para cepas nuevas, como se destaca en la sección de discusión. </li></ol></li><li> Inmediatamente antes del ensayo, transferir orga experimentalA una placa de agar sin bacterias y permitir que los nematodos se muevan libremente durante 1 minuto para eliminar el exceso de bacterias. <ol><li> Si los organismos experimentales experimentaron condiciones de contaminación durante las 24 h antes del ensayo, deséchelos. </li></ol></li><li> Pipetee 1 mL de M9 sobre la placa libre de bacterias para lavar los gusanos en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min. Los gusanos deben formar un pellet en la parte inferior del tubo. Aspirar la solución de M9 sin interrumpir el gránulo de gusano. Añadir 1 ml de M9 a la bola de gusano, invertir el tubo para mezclar los gusanos con la solución. </li><li> Repita los pasos 1.4 tres veces más. <ol><li> Si el exceso de bacterias se transfirió inicialmente con los gusanos, repita un total de 5 veces. No se deben transferir bacterias a las placas de alimentación de cobre. Si el alimento se transfiere a la placa de ensayo, interferirá con la recolección exacta de datos. </li></ol></li><li> Después del lavado final, se aspira el sobrenadante hasta 10081; L de M9 y el gránulo permanece. Precaución: Los comportamientos relacionados con el hambre se hacen evidentes después de 30 min. Por consiguiente, los gusanos deben ser inmediatamente transferidos de la solución una vez que se han completado los pasos de lavado. </li></ol> 2. Preparación de placas de ensayo <ol><li> Preparar placas de agar NGM estándar dos días antes del ensayo. <ol><li> Si las placas se mantienen en un ambiente húmedo, hacer placas de agar 3 días antes del ensayo. Como alternativa, retire la tapa de la placa durante 3 - 6 h para asegurar la sequedad adecuada (si en un ambiente estéril). </li></ol></li><li> Con un marcador permanente grueso, hacer una línea en la parte inferior de la placa a lo largo del borde exterior y otro para formar una barrera de línea media ( Figura 1 ). La barrera de línea media debe estar equidistante de cada borde de la placa. Utilice una regla para asegurar mediciones precisas. Estas líneas servirán de guía para la transferencia de bacterias y la solución de cobre. Siempre queE. coli se transfiere antes de la solución de cobre, estas líneas servirán como indicadores. </li><li> Plato de semilla con 50 μL de OP50 E. coli en un solo lado de la barrera de cobre para crear un césped uniforme ( Figura 2 ). La concentración bacteriana debe permanecer consistente en todos los ensayos; Sin embargo, se ha observado poca variabilidad en respuesta a ligeras diferencias en la concentración. <ol><li> Utilice las líneas marcadas en la parte inferior de la placa para asegurar que las bacterias no entren en contacto con la solución de cobre. Siempre que la solución de cobre alinee el borde de la placa y forme una barrera de línea media, transfiera las bacterias para que la solución de cobre no entre en contacto con la fuente de alimento. </li></ol></li><li> Marque un segundo conjunto de placas y no transfiera ninguna E. coli OP50 ( Figura 2 ). Estas placas servirán para evaluar el control negativo. Estas placas también debenMarcando en la mitad de la placa para indicar el origen de la transferencia inicial. </li><li> Dejar secar las bacterias y luego incubar las placas a 37 ° C durante la noche. Asegúrese de que los parches bacterianos no se alteren al transferir a una incubadora o sala de 37 ° C. Una alteración excesiva podría alterar la ubicación o la forma del parche alimenticio. </li></ol> 3. Ensayo de quimiotaxis <ol><li> Preparar de nuevo una solución de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes de la hora de inicio del ensayo. Siempre que se utilicen 125 μl de la solución por placa, se aumenta este volumen dependiendo del número de placas de ensayo utilizadas ( por ejemplo, 5 placas de ensayo, 625 μl). </li><li> Pipetear 100 μL de la solución de sulfato de cobre (II) en el borde del agar para crear una barrera externa de cobre. La parte inferior marcada de la placa debe servir de guía. </li><li> Pipetear 25 μl de la solución de sulfato de cobre (II) para crear una barrera de línea media. <ol><li> Asegúrese de que la solución de sulfato de cobre (II)No entra en contacto con el parche bacteriano. Utilice una técnica manchada ya que la formación de rayas puede afectar la locomoción debido a las indentaciones / rasguños en el agar. </li></ol></li><li> Deje que la solución de cobre se seque sobre la placa. El período de tiempo puede variar dependiendo de la placa y las condiciones del laboratorio. Compruebe visualmente la sequedad cada 5 minutos después de la transferencia. Nota: La solución de cobre muestra un matiz azulado y es fácilmente identificable. Utilizar un tejido de laboratorio para mojar ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir la sequedad. </li><li> Pipetee 20 μL del sedimento de gusano desde el fondo del tubo sobre la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo. <ol><li> Asegúrese de que 10 gusanos se transfieren a la placa de ensayo. Si los gusanos adicionales se incluyeron accidentalmente, eliminarlos por la recolección con aceite de halocarbono para asegurar que no se agregan bacterias a la placa. Cada ensayo debe tener un número uniforme de nematodos durante el ensayo. NOTA: Si hay pocos gusanos transfErrado durante los ensayos, el aumento del tamaño de la muestra inicial mitigará las pérdidas potenciales durante los lavados y las transferencias. </li></ol></li><li> Retire el exceso de M9 de la placa con un tejido de laboratorio. M9 no debe entrar en contacto con la solución de sulfato de cobre (II). Precaución: Asegúrese de que los gusanos y la superficie del agar no se vean afectados al realizar este paso. Si se utiliza con demasiada dureza, el tejido de laboratorio puede crear muescas en la superficie de agar de la placa y puede eliminar los gusanos. Los gusanos eliminados accidentalmente a través de KimWipe deben desecharse. </li><li> Una vez que la solución M9 se ha eliminado y todos los gusanos han comenzado patrones locomotores no líquidos, iniciar el cronómetro de ensayo. <ol><li> De manera óptima, retire la solución M9 dentro de un minuto. El parámetro esencial es la identificación de la locomoción sinusoidal. Los gusanos se locomotan de manera diferente, por ejemplo , golpeando en lugar de sinusoidal, cuando están en líquido. Iniciar el ensayo de cronómetro una vez cada uno de los órganos experimentalesIsmos deja de golpear. </li></ol></li><li> Revise las placas de ensayo cada 30 min. <ol><li> Para las placas de ensayo con parches bacterianos, marque positivamente los organismos si alcanzan el parche de alimentos durante un periodo de 4 h. Para las placas de control negativo, marque positivamente los organismos si han cruzado la barrera. </li></ol></li></ol>

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No tenemos nada que revelar.

Este diseño de ensayo modifica el ensayo 24 de raza alimentaria para incluir una solución de cobre para crear una barrera aversiva de línea media y alrededor del borde de la placa para evitar la pérdida de nematodos. Los organismos se ponen a prueba para determinar su capacidad para cruzar la barrera aversiva y alcanzar un parche alimenticio durante un período de 4 h. En el contexto de npr-9 (GF) , hemos utilizado este ensayo para evaluar cómo las condiciones de inanición podrían...

Caenorhabditis elegans se ha utilizado como modelo para el estudio de la neurobiología durante décadas debido a la relativa facilidad en el análisis de los circuitos de un sistema nervioso compuesto por sólo 302 neuronas [ 1] . Siempre que el organismo dependa de responder a señales ambientales, gran parte del sistema nervioso se dedica a regular la integración de las señales ambientales 2 . A pesar de la simplicidad de su sistema nervioso, C. elegans puede detectar y responder a diversas señales ambientales incluyendo repelentes 3 , atrayentes 4 , temperatura 5 e incluso humedad 6 . Un fallo para integrar adecuadamente las señales ambientales se ha relacionado con una serie de trastornos del comportamiento y condiciones neurodegenerativas en los sistemas modelo de mamíferos [ 7 - 9] . Con una gama de modelos disponibles de enfermedad neural<html> 10 en C. elegans y el desarrollo de pantallas farmacéuticas de nematodos 11 , este organismo ha demostrado ser un sistema útil para el estudio de la neurobiología. Dada la disponibilidad de un nematodo asignado 1 y de mutaciones a casi todos los genes del nematodo genoma 12 , nuestra comprensión del sistema nervioso de los nematodos, y por extensión nuestra, está parcialmente limitada por el diseño de ensayos creativamente apropiados. Se han desarrollado varios ensayos de quimiotaxis durante los últimos 40 años para evaluar la respuesta de los nematodos a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . La experimentación inicial implicó la introducción de un estímulo ambiental agudo mientras que un solo gusano vagaba sobre una placa de agar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Se registraron cambios inmediatos en las respuestas locomotoras. Por ejemplo, el octanol odorante volátil puede aplicarse a un cabello y ponerse delante de la nariz de un nematodo para estimular el inicio de la locomoción hacia atrás en gusanos de tipo salvaje [ 17] . También se han desarrollado ensayos más complejos para incorporar múltiples variables como medio de evaluar la elección del comportamiento 18 . Una variación de este ensayo implica el uso de una solución de cobre para crear una barrera aversiva de la línea media 4 . Un atrayente, es decir, diacetil, se colocó en un lado de la barrera química con gusanos transferidos lejos de la fuente de diacetilo. Los gusanos defectuosos para las respuestas de aversión al cobre cruzaron inmediatamente la barrera para alcanzar el diacetilo, mientras que los gusanos de tipo silvestre fueron repelidos inicialmente por la barrera. Las respuestas fueron anotadas cuando los gusanos se acercaron por primera vez a la barrera de cobreSin observaciones a largo plazo. Cuando los gusanos son evaluados después de sufrir condiciones de inanición, su sensibilidad a los estímulos ambientales se reduce 19 . Cuando el octanol químico aversivo se deposita frente a la nariz del nematodo, los organismos de tipo silvestre estimulan el movimiento hacia atrás dentro de 3-5 s cuando se alimentan. Después de que estos organismos se han retirado de los alimentos durante 10 min, que muestran una respuesta tardía de 8 - 10 s 20 . Por lo tanto, con el aumento de la inanición, los nematodos muestran una menor respuesta aversiva a las señales ambientales perjudiciales como la búsqueda de alimentos se vuelve más esencial para la supervivencia. Por el contrario, los nematodos que sobreexpresan el receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , no responden al octanol en o fuera de los alimentos y muestran una incapacidad para responder a una serie de estímulos aversivos [ 21] . Estos organismos npr-9 (GF) también no modulan su frecuencia de inversión en presencia de alimento, pero puedenInversa en respuesta a los estímulos de tacto áspero que indica que son capaces de locomoción hacia atrás 21 . También hemos evaluado mutantes npr-9 (LF) dado que exhiben una frecuencia anormalmente baja de inversión de la comida, sin embargo, puede modular su comportamiento en la presencia de alimentos [ 21] . El acoplamiento del estado nutricional del gusano con la introducción de estímulos externos agudos ha ayudado a dilucidar los mecanismos por los cuales una vía alimentaria puede modular ampliamente las vías de señalización sensorial 22 , 23 . La presencia de alimentos en el medio ambiente de nematodos también se ha utilizado para evaluar las respuestas de abstinencia de etanol [ 24] . En este experimento, los gusanos se incubaron en diversas concentraciones de etanol y luego se colocaron en una placa de agar con un parche de alimento conocido como un &quot;ensayo de raza alimentaria&quot;. El parche de alimentos se colocó en un borde de la placa, mientras que los nematodos wSe colocan lejos de la fuente de alimento. La retirada de etanol se evaluó midiendo la duración del tiempo requerido para que los gusanos alcanzaran el parche de alimento. Este ensayo de aversión al cobre basado en la nutrición se basa en el ensayo de raza alimentaria para integrar variables ambientales adicionales, a saber, alimentos y cobre, a la vez que se evalúan los cambios de comportamiento a lo largo del tiempo. Esta es una adaptación de un protocolo de uso común en toda la comunidad C. elegans 4 . Este protocolo se ha utilizado para evaluar las respuestas aversivas y la detección de alimentos durante un período de cuatro horas [ 21] . Dado que los gusanos muestran comportamientos de hambre después de 30 minutos de privación de alimentos 25 , también podemos evaluar cómo los cambios en el estado nutricional pueden influir en las respuestas ambientales. Las condiciones de este ensayo miden cómo los organismos experimentales cambian la respuesta a los estímulos aversivos con el tiempo, por lo que se evalúan los cambios de comportamiento comoLos organismos progresan hacia un estado de hambre (y las mediciones continuadas de hambre prolongada). Dado que los animales npr-9 (GF) no alteran su comportamiento en respuesta a alimentos o muchas señales aversivas, buscamos identificar si estos déficits de comportamiento persistirían en el contexto de hambre. En última instancia, este diseño de ensayo se ha formulado para evaluar específicamente los mutantes npr-9 (GF), pero puede adaptarse adicionalmente para caracterizar también cepas nuevas.

<table><tbody><tr><td>M9 Solution [3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td><td></td><td></td><td>Produced in lab</td></tr><tr><td>Cupric Sulfate</td><td>Sigma</td><td>C-1297</td><td>Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td></tr></tbody></table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Para garantizar la supervivencia, los organismos deben ser capaces de evitar los hábitats desfavorables al tiempo que garantizan una fuente de alimento consistente. Caenorhabditis elegans alteran sus patrones locomotores tras la detección de diversos estímulos ambientales y pueden modular su conjunto de respuestas conductuales en respuesta a las condiciones de hambre. Los nematodos presentan típicamente una respuesta aversiva disminuida cuando se eliminan de una fuente de alimento durante más de 30 min. La observación de los cambios de comportamiento en respuesta a un estado nutricional cambiante puede proporcionar una visión de los mecanismos que regulan la transición de un estado bien alimentado a un estado de hambre. Hemos desarrollado un ensayo que mide la capacidad de un nematodo para atravesar una barrera aversiva ( es decir, cobre) y luego alcanzar una fuente de alimento durante un período prolongado de tiempo. Este protocolo se basa en el trabajo previo mediante la integración de múltiples variables de una manera que permite la continua recogida de datos a medida que los organismos se desplazan hacia unN cada vez más hambre. Además, este ensayo permite un aumento del tamaño de la muestra de modo que pueden evaluarse simultáneamente poblaciones mayores de nematodos. Organismos defectuosos para la capacidad de detectar o responder al cobre inmediatamente cruzar la barrera química, mientras que los nematodos de tipo salvaje son inicialmente repelidos. Como gusanos de tipo silvestre son cada vez más hambre, comienzan a cruzar la barrera y llegar a la fuente de alimentos. Hemos diseñado este ensayo para evaluar un mutante que es incapaz de responder a diversas señales ambientales, incluyendo la sensación de alimentos o la detección de productos químicos aversivos. Cuando se evaluaron a través de este protocolo, los organismos defectuosos cruzaron inmediatamente la barrera, pero también fueron incapaces de detectar una fuente de alimento. Por lo tanto, estos mutantes cruzan repetidamente la barrera química a pesar de llegar temporalmente a una fuente de alimento. Este ensayo puede probar directamente las poblaciones de gusanos para evaluar los posibles defectos de la vía relacionados con la aversión y la inanición.

Se utilizaron cepas de tipo salvaje (N2), npr-9 (tm1652) y una cepa de sobreexpresión npr-9 , es decir npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para evaluar las respuestas a la inanición y la aversión al cobre. Los organismos de tipo salvaje son capaces de detectar y responder a la barrera aversiva de cobre, mientras que los mutantes npr-9 (GF) no inician una respuesta aversiva al cobre durante el ...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional

Aquí, presentamos un ensayo específico de Caenorhabditis elegans diseñado para evaluar los cambios en el comportamiento de aversión al cobre y la capacidad de localizar una fuente de alimento común, a medida que el organismo progresa de un estado nutricional bien alimentado a hambriento.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.5K vistas.  Queen's University.  Aquí, presentamos un ensayo específico de Caenorhabditis elegans diseñado para evaluar los cambios en el comportamiento de aversión al cobre y la capacidad de localizar una fuente de alimento común, a medida que el organismo progresa de un estado nutricional bien alimentado a hambriento. 

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Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Investigación

Comportamiento

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Medio ambiente

Ensayo de alto rendimiento para medir la ingesta de alimentos y la esperanza de vida de Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor destacado: Explorando la relación entre la lipotoxicidad y la HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neurociencias

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Biología

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

UN

Resumen

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Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Medición de la resistencia de estrés oxidativo

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas