Name: a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaften Council of Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 an William G. Bendena unterstützt.

1. Vorbereitung von experimentellen Organismen <ol><li> Wählen Sie 10 L4 inszenierte Nematoden pro Stamm 24 h vor Beginn des Assays, um sicherzustellen, dass Organismen junge Erwachsene sind, wenn sie getestet werden. Für jede Mutante oder Kontroll-Nematode getestet, wählen Sie 10 L4s (10 für die Kontrolle und 10 für den Assay). <ol><li> Halten Sie L4-Organismen unter Verwendung der Standardmethoden 26 , 27 für 24 h auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coli seediert wurden. Wenn Organismen während der nachfolgenden Waschschritte verloren gehen, kompensieren Sie durch Erhöhung der Startprobengröße ( dh 20 Würmer anstatt 10). Anmerkung: Verhalten ist ein innig variabler Phänotyp. Führen Sie die Methode in dreifacher Ausfertigung für jede Belastung an drei getrennten Tagen durch. Fügen Sie zusätzliche Kontrollstämme und Bedingungen für neuartige Stämme ein, wie im Diskussionsbereich hervorgehoben. </li></ol></li><li> Unmittelbar vor dem Test, Transfer experimentelle OrgaNismen zu einer Agarplatte ohne Bakterien und erlauben Nematoden, sich frei für 1 min zu bewegen, um überschüssige Bakterien zu entfernen. <ol><li> Wenn experimentelle Organismen während des 24 h vor dem Assay Kontamination Bedingungen erlebt haben, verwerfen sie. </li></ol></li><li> 1 ml M9 auf die bakterienfreie Platte pipettieren, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen. </li><li> Zentrifuge bei 3.000 xg für 1 min. Würmer sollten ein Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmpellet zu stören. Füge 1 ml M9 zum Wurm-Pellet hinzu, umschleife die Röhrchen mit der Lösung. </li><li> Wiederholen Sie Schritte 1.4 drei weitere Male. <ol><li> Wenn überschüssige Bakterien zunächst mit den Würmern transferiert wurden, wiederholen Sie sich für insgesamt 5 mal. Keine Bakterien sollten auf die Kupfer-Food-Race-Platten übertragen werden. Wenn das Essen auf die Testplatte übertragen wird, wird es eine genaue Datenerfassung beeinträchtigen. </li></ol></li><li> Nach der letzten Wäsche, Absaugen Überstand bis 10081, L von M9 und das Wurmpellet bleibt. Achtung: Verhungernde Verhaltensweisen werden nach 30 min deutlich. Folglich sollten die Würmer sofort aus der Lösung übertragen werden, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind. </li></ol> 2. Vorbereitung von Testplatten <ol><li> Vorbereiten der Standard-NGM-Agarplatten zwei Tage vor dem Assay. <ol><li> Wenn die Platten in einer feuchten Umgebung gehalten werden, machen Agarplatten 3 Tage vor dem Test. Alternativ entfernen Sie den Deckel der Platte für 3 - 6 Stunden, um eine ordnungsgemäße Trockenheit zu gewährleisten (wenn in einer sterilen Umgebung). </li></ol></li><li> Mit einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite der Platte entlang der äußeren Kante und eine andere, um eine Mittellinie Barriere ( Abbildung 1 ) zu bilden. Die Mittellinienbarriere sollte von jeder Kante der Platte gleich weit entfernt sein. Verwenden Sie ein Lineal, um genaue Messungen zu gewährleisten. Diese Linien dienen als Leitfaden bei der Übertragung von Bakterien und der Kupferlösung. Unter der Vorraussetzung, dassE. coli wird vor der Kupferlösung übertragen, diese Zeilen dienen als Indikatoren. </li><li> Samenplatte mit 50 μl OP50 E. coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen ( Abbildung 2 ). Die Bakterienkonzentration sollte über die Assays hinweg konsistent bleiben; Jedoch wurde eine kleine Variabilität in Reaktion auf leichte Konzentrationsunterschiede beobachtet. <ol><li> Benutze die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Vorausgesetzt, dass die Kupferlösung den Rand der Platte bildet und eine Mittelliniensperre bildet, übertragen die Bakterien, so dass die Kupferlösung nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommt. </li></ol></li><li> Markieren Sie einen zweiten Satz von Platten und übertragen Sie keine OP50 E. coli zu ihnen ( Abbildung 2 ). Diese Platten dienen zur Bewertung der Negativkontrolle. Diese Platten sollten auch eineMarkierung auf einer Hälfte der Platte, um den ursprünglichen Transferursprung zu bezeichnen. </li><li> Bakterien trocknen lassen, dann die Platten bei 37 ° C über Nacht inkubieren. Sicherstellen, dass bakterielle Flecken bei der Übertragung auf einen 37 ° C Inkubator oder Raum nicht gestört werden. Übermäßige Störung könnte die Lage oder Form des Nahrungsmittelflecks verändern. </li></ol> 3. Chemotaxis-Assay <ol><li> Frisch eine 0,5 M Kupfer (II) sulfatlösung vor der Teststartzeit vorbereiten. Sofern 125 μl der Lösung pro Platte verwendet werden, wird dieses Volumen abhängig von der Anzahl der verwendeten Testplatten ( z. B. 5 Testplatten, 625 μL) skaliert. </li><li> 100 μl der Kupfer (II) sulfatlösung am Rand des Agars pipettieren, um eine äußere Kupferbarriere zu erzeugen. Die markierte Unterseite der Platte sollte als Leitfaden dienen. </li><li> 25 μl der Kupfer (II) sulfatlösung pipettieren, um eine Mittellinienbarriere zu erzeugen. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass sich die Kupfer (II) sulfatlösung ergibtEs kommt nicht mit dem Bakterienfleck in Berührung. Verwenden Sie eine gefleckte Technik als Streifen kann die Fortbewegung aufgrund von Einbuchtungen / Kratzer auf dem Agar beeinflussen. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Kupferlösung auf die Platte trocknen. Der Zeitraum kann je nach Platten- und Laborbedingungen variieren. Überprüfen Sie alle 5 Minuten nach der Übertragung auf Trockenheit. Anmerkung: Die Kupferlösung zeigt eine blaue Tönung und ist leicht zu identifizieren. Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Lösung in der Nähe des Randes der Platte leicht zu tupfen, um die Trockenheit zu erkennen . </li><li> 20 μl des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte pipettieren. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich eingeschlossen waren, entfernen Sie sie, indem Sie mit Halogenkohlenstofföl pflücken, um sicherzustellen, dass keine Bakterien der Platte hinzugefügt werden. Jeder Assay sollte eine konsistente Anzahl von Nematoden während des Assays haben. HINWEIS: Wenn zu wenige Würmer transf sindFehlerhaft während der Assays, die Erhöhung der anfänglichen Stichprobengröße wird potenzielle Verluste während der Waschungen und Transfers abschwächen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie überschüssiges M9 aus der Platte mit einem Laborgewebe. M9 sollte nicht mit der Kupfer (II) sulfatlösung in Berührung kommen. Achtung: Sicherstellen, dass die Würmer und die Agaroberfläche bei dieser Ausführung unberührt bleiben. Wenn es zu hart verwendet wird, kann das Laborgewebe Vertiefungen auf die Agaroberfläche der Platte erzeugen und Würmer entfernen. Würmer, die zufällig über KimWipe entfernt wurden, sollten verworfen werden. </li><li> Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer mit nicht-flüssigen Lokomotionsmustern begonnen haben, starten Sie die Teststoppuhr. <ol><li> Optimal entfernen Sie die M9-Lösung innerhalb eines min. Der wesentliche Parameter ist die Identifizierung der sinusförmigen Fortbewegung. Würmer locomote anders, z. B. Thrash anstatt sinusförmig, wenn in Flüssigkeit. Starten Sie die Assay Stoppuhr einmal jedes der experimentellen OrgelIsms hört auf zu schlagen </li></ol></li><li> Überprüfen Sie alle 30 min. <ol><li> Für die Assay-Platten mit bakteriellen Patches, positiv Score-Organismen, wenn sie die Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden erreichen. Für die negativen Kontrollplatten, positiv Kerbe Organismen, wenn sie die Barriere überschritten haben. </li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Diese Assay-Konstruktion modifiziert den Nahrungsmittel-Race-Assay 24 , um eine Kupferlösung zu umfassen, um eine aversive Mittellinien-Barriere und um den Rand der Platte zu schaffen, um einen Verlust von Nematoden zu verhindern. Organismen sind auf ihre Fähigkeit, die aversive Barriere zu überqueren und erreichen ein Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden getestet. Im Kontext von npr-9 (GF) haben wir diesen Assay verwendet, um zu bewerten, wie Hungerbedingungen aversi...

Caenorhabditis elegans wurde als Modell für das Studium der Neurobiologie seit Jahrzehnten aufgrund der relativen Leichtigkeit bei der Analyse der Schaltungen eines Nervensystems aus nur 302 Neuronen 1 verwendet . Vorausgesetzt, dass der Organismus auf die Reaktion auf Umwelt-Cues angewiesen ist, ist ein Großteil des Nervensystems der Regulierung der Integration von Umweltsignalen gewidmet 2 . Trotz der Einfachheit seines Nervensystems kann C. elegans verschiedene Umweltsignale erkennen und darauf reagieren, einschließlich Repellents 3 , Lockstoffe 4 , Temperatur 5 und sogar Feuchtigkeit 6 . Ein nicht ordnungsgemäß Umweltsignale integrieren hat zu einer Reihe von Verhaltensstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Säugern Modellsystemen 7- 9 verbunden. Mit einer Reihe von verfügbaren neuralen Krankheit Modelle<html> 10 in C. elegans und die Entwicklung von Nematoden-Pharma-Bildschirmen 11 hat sich dieser Organismus als ein nützliches System für das Studium der Neurobiologie erwiesen. Angesichts der Verfügbarkeit eines abgebildeten Nematoden-Verbundes 1 und Mutationen für fast jedes Gen im Nematoden-Genom 12 ist unser Verständnis des Nematoden-Nervensystems und durch die Erweiterung unserer eigenen teilweise durch die Gestaltung von kreativ geeigneten Assays begrenzt. Eine Reihe von Chemotaxis-Assays wurden in den letzten 40 Jahren entwickelt, um die Nematoden-Ansprechempfindlichkeit auf verschiedene aversive Stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 zu bewerten. Initiale Experimente waren die Einführung eines akuten Umwelteinflusses, während ein einziger Wurm auf einer Agarplatte durchstreifte= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Sofortige Änderungen der Lokomotionsreaktionen wurden aufgezeichnet. Zum Beispiel kann der flüchtige Geruchsstoff Octanol auf ein Haar aufgetragen werden und vor einem Nematoden der Nase geweht 17 die Einleitung rückwärts Fortbewegung in Wildtyp - Würmern zu stimulieren. Komplexere Assays wurden auch entwickelt, um mehrere Variablen als Mittel zur Bewertung der Verhaltensauswahl zu integrieren 18 . Eine Variation dieses Assays beinhaltet die Verwendung einer Kupferlösung, um eine aversive Mittellinienbarriere 4 zu erzeugen. Ein Lockmittel, nämlich Diacetyl, wurde auf einer Seite der chemischen Barriere mit Würmern, die von der Diacetylquelle weg übertragen wurden, platziert. Würmer defekt für Kupfer aversive Reaktionen sofort über die Barriere, um das Diacetyl zu erreichen, während Wildtyp-Würmer wurden zunächst von der Barriere abgelehnt. Responses wurden erzielt, als Würmer zuerst die Kupferbarriere nähertenOhne langfristige Beobachtungen. Wenn Würmer ausgewertet werden nach Hungerbedingungen unterzogen, ihre Empfindlichkeit auf Umweltreize 19 verringert. Wenn das aversive chemische Octanol vor der Nematoden-Nase geweht wird, stimulieren Wildtyp-Organismen die Rückwärtsbewegung innerhalb von 3 - 5 s, wenn sie auf Nahrung sind. Nachdem diese Organismen 10 Minuten aus der Nahrung entfernt worden sind, zeigen sie eine verzögerte Reaktion von 8 - 10 s 20 . So zeigen Nematoden mit erhöhtem Hunger eine verminderte aversive Reaktion auf schädliche Umweltsignale, da die Suche nach Nahrung für das Überleben wesentlich wird. Umgekehrt reagieren Nematoden, die den Neuropeptidrezeptor 9 ( npr-9) überexprimieren , nicht auf Octanol auf oder aus der Nahrung und zeigen eine Unfähigkeit, auf eine Anzahl von aversiven Reizen zu reagieren 21 . Diese npr-9 (GF) -Organismen modulieren auch nicht ihre Umkehrfrequenz in Gegenwart von Nahrung, sondern könnenUmgekehrt als Reaktion auf harte Berührungsstimulationen, die darauf hinweisen, dass sie in der Lage sind, Rückwärts-Fortbewegung 21 zu machen . Wir haben auch npr-9 (LF) -Mutanten ausgewertet, da sie eine ungewöhnlich verminderte Umkehrfrequenz aus der Nahrung aufweisen und dennoch ihr Verhalten in Gegenwart von Nahrung modulieren können 21 . Die Kopplung des Ernährungszustandes des Wurms mit der Einführung akuter externer Reize hat bei der Aufklärung der Mechanismen unterstützt, mit denen ein lebensmittelbezogener Weg die sensorischen Signalwege 22 , 23 weitgehend modulieren kann. Die Anwesenheit von Speisen in der Nematodenumgebung wurde auch verwendet, um Ethanol-Entzugsantworten zu bewerten 24 . In diesem Experiment wurden die Würmer in unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol inkubiert und dann auf eine Agarplatte mit einem Nahrungsmittelfleck, das als &quot;Food-Race Assay&quot; bekannt war, platziert. Der Nahrungsmittelfleck wurde auf eine Kante der Platte gelegt, während die Nematoden wVon der Nahrungsquelle entfernt. Der Ethanolentzug wurde durch Messung der Zeitdauer gemessen, die für die Würmer benötigt wurde, um den Lebensmittelfleck zu erreichen. Dieser Nährstoff-basierte Kupfer-Aversion-Assay baut auf dem Food-Race-Assay auf, um zusätzliche Umgebungsvariablen, nämlich Nahrung und Kupfer, zu integrieren und dabei Verhaltensänderungen im Laufe der Zeit zu bewerten. Dies ist eine Anpassung eines gemeinnützigen Protokolls in der gesamten C. elegans- Gemeinschaft 4 . Dieses Protokoll wurde verwendet, um aversive Reaktionen und die Erkennung von Lebensmitteln über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten 21 . Da die Wurmaussetzveranstaltungen nach 30 min Nahrungsdeprivation 25 zeigen , können wir auch beurteilen, wie sich Veränderungen des Ernährungszustands auf Umweltreaktionen auswirken können. Die Bedingungen dieses Assays messen, wie experimentelle Organismen die Reaktionsfähigkeit auf aversive Stimuli im Laufe der Zeit verändern und damit Verhaltensänderungen bewertenOrganismen Fortschritte in Richtung eines ausgehungerten Zustandes (und fortgesetzte Messungen des verlängerten Hungers). Da die npr-9 (GF) Tiere ihr Verhalten nicht als Reaktion auf Nahrung oder viele aversive Cues verändern, haben wir versucht zu erkennen, ob diese Verhaltensdefizite im Kontext des Hungers bestehen würden. Letztlich wurde dieses Assay-Design formuliert, um die npr-9 (GF) -Mutanten spezifisch zu bewerten, sondern kann auch angepasst werden, um auch neue Stämme zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>M9 Solution [3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td><td></td><td></td><td>Produced in lab</td></tr><tr><td>Cupric Sulfate</td><td>Sigma</td><td>C-1297</td><td>Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td></tr></tbody></table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Um das Überleben zu sichern, müssen die Organismen in der Lage sein, ungünstige Lebensräume zu vermeiden und gleichzeitig eine gleichbleibende Nahrungsquelle zu gewährleisten. Caenorhabditis elegans verändern ihre Lokomotionsmuster bei der Erkennung diverser Umwelteinflüsse und können ihre Abhängigkeit von Verhaltensreaktionen als Reaktion auf Hungerbedingungen modulieren. Nematoden zeigen typischerweise eine verringerte aversive Antwort, wenn sie aus einer Nahrungsmittelquelle für mehr als 30 min entfernt werden. Die Beobachtung von Verhaltensänderungen in Reaktion auf einen sich ändernden Ernährungsstatus kann Einblick in die Mechanismen geben, die den Übergang von einem gut gefütterten in den verhungerten Zustand regeln. Wir haben einen Assay entwickelt, der die Fähigkeit eines Nematoden misst, eine aversive Barriere ( dh Kupfer) zu überqueren und dann über einen längeren Zeitraum eine Nahrungsquelle zu erreichen. Dieses Protokoll baut auf früheren Arbeiten auf, indem es mehrere Variablen in einer Weise integriert, die eine fortlaufende Datenerfassung ermöglicht, während sich die Organismen zu einemN zunehmend verhungert. Darüber hinaus erlaubt dieser Assay eine erhöhte Probengröße, so dass größere Populationen von Nematoden gleichzeitig ausgewertet werden können. Organismen, die für die Fähigkeit, Kupfer zu erkennen oder zu reagieren, sofort die chemische Barriere kreuzen, während Wildtyp-Nematoden anfänglich abgestoßen werden. Da Wildtyp-Würmer zunehmend verhungert sind, beginnen sie, die Barriere zu überqueren und die Nahrungsquelle zu erreichen. Wir haben diesen Assay entworfen, um eine Mutante zu bewerten, die nicht in der Lage ist, auf verschiedene Umwelt-Cues zu reagieren, einschließlich der Nahrungsmittelempfindung oder des Nachweises von aversiven Chemikalien. Wenn sie über dieses Protokoll ausgewertet wurden, überquerten die defekten Organismen sofort die Barriere, waren aber auch nicht in der Lage, eine Nahrungsmittelquelle zu detektieren. Daher kreuzen diese Mutanten wiederholt die chemische Barriere, obwohl sie vorübergehend eine Nahrungsquelle erreichen. Dieser Assay kann einfach die Populationen von Würmern testen, um mögliche Wegdefekte im Zusammenhang mit Abneigung und Hunger zu bewerten.

Wir nutzten Wildtyp (N2), npr-9 (tm1652) und einen npr-9- Überexpressionsstamm, dh npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), um Antworten auf Hunger und Kupferabwehr zu bewerten. Wildtyp-Organismen sind in der Lage, die aversive Kupferbarriere zu detektieren und zu reagieren, während npr-9 (GF) -Mutanten keine aversive Antwort auf das Kupfer über den 4 h-Assay 21 auslösen. Nach 30 mi...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

EIN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.5K Aufrufe.  Queen's University.  Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet. 

Serie: A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Forschung

Verhalten

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Umwelt

Hochdurchsatz-Assay zur Messung der Nahrungsaufnahme und Lebensdauer von Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor im Rampenlicht: Erforschung des Zusammenhangs zwischen Lipotoxizität und HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neurowissenschaften

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Biologie

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

EIN

Zusammenfassung

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Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat

Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen