Diese Arbeit wurde von der Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaften Council of Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 an William G. Bendena unterstützt.

1. Vorbereitung von experimentellen Organismen <ol><li> Wählen Sie 10 L4 inszenierte Nematoden pro Stamm 24 h vor Beginn des Assays, um sicherzustellen, dass Organismen junge Erwachsene sind, wenn sie getestet werden. Für jede Mutante oder Kontroll-Nematode getestet, wählen Sie 10 L4s (10 für die Kontrolle und 10 für den Assay). <ol><li> Halten Sie L4-Organismen unter Verwendung der Standardmethoden 26 , 27 für 24 h auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coli seediert wurden. Wenn Organismen während der nachfolgenden Waschschritte verloren gehen, kompensieren Sie durch Erhöhung der Startprobengröße ( dh 20 Würmer anstatt 10). Anmerkung: Verhalten ist ein innig variabler Phänotyp. Führen Sie die Methode in dreifacher Ausfertigung für jede Belastung an drei getrennten Tagen durch. Fügen Sie zusätzliche Kontrollstämme und Bedingungen für neuartige Stämme ein, wie im Diskussionsbereich hervorgehoben. </li></ol></li><li> Unmittelbar vor dem Test, Transfer experimentelle OrgaNismen zu einer Agarplatte ohne Bakterien und erlauben Nematoden, sich frei für 1 min zu bewegen, um überschüssige Bakterien zu entfernen. <ol><li> Wenn experimentelle Organismen während des 24 h vor dem Assay Kontamination Bedingungen erlebt haben, verwerfen sie. </li></ol></li><li> 1 ml M9 auf die bakterienfreie Platte pipettieren, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen. </li><li> Zentrifuge bei 3.000 xg für 1 min. Würmer sollten ein Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmpellet zu stören. Füge 1 ml M9 zum Wurm-Pellet hinzu, umschleife die Röhrchen mit der Lösung. </li><li> Wiederholen Sie Schritte 1.4 drei weitere Male. <ol><li> Wenn überschüssige Bakterien zunächst mit den Würmern transferiert wurden, wiederholen Sie sich für insgesamt 5 mal. Keine Bakterien sollten auf die Kupfer-Food-Race-Platten übertragen werden. Wenn das Essen auf die Testplatte übertragen wird, wird es eine genaue Datenerfassung beeinträchtigen. </li></ol></li><li> Nach der letzten Wäsche, Absaugen Überstand bis 10081, L von M9 und das Wurmpellet bleibt. Achtung: Verhungernde Verhaltensweisen werden nach 30 min deutlich. Folglich sollten die Würmer sofort aus der Lösung übertragen werden, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind. </li></ol> 2. Vorbereitung von Testplatten <ol><li> Vorbereiten der Standard-NGM-Agarplatten zwei Tage vor dem Assay. <ol><li> Wenn die Platten in einer feuchten Umgebung gehalten werden, machen Agarplatten 3 Tage vor dem Test. Alternativ entfernen Sie den Deckel der Platte für 3 - 6 Stunden, um eine ordnungsgemäße Trockenheit zu gewährleisten (wenn in einer sterilen Umgebung). </li></ol></li><li> Mit einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite der Platte entlang der äußeren Kante und eine andere, um eine Mittellinie Barriere ( Abbildung 1 ) zu bilden. Die Mittellinienbarriere sollte von jeder Kante der Platte gleich weit entfernt sein. Verwenden Sie ein Lineal, um genaue Messungen zu gewährleisten. Diese Linien dienen als Leitfaden bei der Übertragung von Bakterien und der Kupferlösung. Unter der Vorraussetzung, dassE. coli wird vor der Kupferlösung übertragen, diese Zeilen dienen als Indikatoren. </li><li> Samenplatte mit 50 μl OP50 E. coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen ( Abbildung 2 ). Die Bakterienkonzentration sollte über die Assays hinweg konsistent bleiben; Jedoch wurde eine kleine Variabilität in Reaktion auf leichte Konzentrationsunterschiede beobachtet. <ol><li> Benutze die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Vorausgesetzt, dass die Kupferlösung den Rand der Platte bildet und eine Mittelliniensperre bildet, übertragen die Bakterien, so dass die Kupferlösung nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommt. </li></ol></li><li> Markieren Sie einen zweiten Satz von Platten und übertragen Sie keine OP50 E. coli zu ihnen ( Abbildung 2 ). Diese Platten dienen zur Bewertung der Negativkontrolle. Diese Platten sollten auch eineMarkierung auf einer Hälfte der Platte, um den ursprünglichen Transferursprung zu bezeichnen. </li><li> Bakterien trocknen lassen, dann die Platten bei 37 ° C über Nacht inkubieren. Sicherstellen, dass bakterielle Flecken bei der Übertragung auf einen 37 ° C Inkubator oder Raum nicht gestört werden. Übermäßige Störung könnte die Lage oder Form des Nahrungsmittelflecks verändern. </li></ol> 3. Chemotaxis-Assay <ol><li> Frisch eine 0,5 M Kupfer (II) sulfatlösung vor der Teststartzeit vorbereiten. Sofern 125 μl der Lösung pro Platte verwendet werden, wird dieses Volumen abhängig von der Anzahl der verwendeten Testplatten ( z. B. 5 Testplatten, 625 μL) skaliert. </li><li> 100 μl der Kupfer (II) sulfatlösung am Rand des Agars pipettieren, um eine äußere Kupferbarriere zu erzeugen. Die markierte Unterseite der Platte sollte als Leitfaden dienen. </li><li> 25 μl der Kupfer (II) sulfatlösung pipettieren, um eine Mittellinienbarriere zu erzeugen. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass sich die Kupfer (II) sulfatlösung ergibtEs kommt nicht mit dem Bakterienfleck in Berührung. Verwenden Sie eine gefleckte Technik als Streifen kann die Fortbewegung aufgrund von Einbuchtungen / Kratzer auf dem Agar beeinflussen. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Kupferlösung auf die Platte trocknen. Der Zeitraum kann je nach Platten- und Laborbedingungen variieren. Überprüfen Sie alle 5 Minuten nach der Übertragung auf Trockenheit. Anmerkung: Die Kupferlösung zeigt eine blaue Tönung und ist leicht zu identifizieren. Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Lösung in der Nähe des Randes der Platte leicht zu tupfen, um die Trockenheit zu erkennen . </li><li> 20 μl des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte pipettieren. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich eingeschlossen waren, entfernen Sie sie, indem Sie mit Halogenkohlenstofföl pflücken, um sicherzustellen, dass keine Bakterien der Platte hinzugefügt werden. Jeder Assay sollte eine konsistente Anzahl von Nematoden während des Assays haben. HINWEIS: Wenn zu wenige Würmer transf sindFehlerhaft während der Assays, die Erhöhung der anfänglichen Stichprobengröße wird potenzielle Verluste während der Waschungen und Transfers abschwächen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie überschüssiges M9 aus der Platte mit einem Laborgewebe. M9 sollte nicht mit der Kupfer (II) sulfatlösung in Berührung kommen. Achtung: Sicherstellen, dass die Würmer und die Agaroberfläche bei dieser Ausführung unberührt bleiben. Wenn es zu hart verwendet wird, kann das Laborgewebe Vertiefungen auf die Agaroberfläche der Platte erzeugen und Würmer entfernen. Würmer, die zufällig über KimWipe entfernt wurden, sollten verworfen werden. </li><li> Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer mit nicht-flüssigen Lokomotionsmustern begonnen haben, starten Sie die Teststoppuhr. <ol><li> Optimal entfernen Sie die M9-Lösung innerhalb eines min. Der wesentliche Parameter ist die Identifizierung der sinusförmigen Fortbewegung. Würmer locomote anders, z. B. Thrash anstatt sinusförmig, wenn in Flüssigkeit. Starten Sie die Assay Stoppuhr einmal jedes der experimentellen OrgelIsms hört auf zu schlagen </li></ol></li><li> Überprüfen Sie alle 30 min. <ol><li> Für die Assay-Platten mit bakteriellen Patches, positiv Score-Organismen, wenn sie die Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden erreichen. Für die negativen Kontrollplatten, positiv Kerbe Organismen, wenn sie die Barriere überschritten haben. </li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Diese Assay-Konstruktion modifiziert den Nahrungsmittel-Race-Assay 24 , um eine Kupferlösung zu umfassen, um eine aversive Mittellinien-Barriere und um den Rand der Platte zu schaffen, um einen Verlust von Nematoden zu verhindern. Organismen sind auf ihre Fähigkeit, die aversive Barriere zu überqueren und erreichen ein Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden getestet. Im Kontext von npr-9 (GF) haben wir diesen Assay verwendet, um zu bewerten, wie Hungerbedingungen aversive Reaktionen und den Nachweis von Nahrung beeinflussen könnten. Vorausgesetzt, dass wir zuvor npr-9 (GF) als fehlerhaft für die Reaktionsfähigkeit auf Nahrung und aversive Cues charakterisiert hatten , kombinierten wir Multiples Umweltzeichen mit Ernährungsstatus, um zu bewerten, ob Hunger das defekte npr-9 (GF) -Verfahren modulieren könnte. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit eines Wurms, chemische Reize und Lebensmittel-Cues 3 , 4 zu erkennen und zu reagieren. Angesichts der verschiedenen analysierten Variablen wurden die Bedingungen der ExPerimentalorganismen müssen sorgfältig kontrolliert werden, um verwirrende Faktoren zu beseitigen. Für nicht charakterisierte Mutanten, dh solche mit unbekannter aversiver oder Nahrungsmittelreaktion, müssten zusätzliche Kontrollstämme verwendet werden. Aversive Defektstämme, z. B. Che-2 oder Odr-3 28 , und Mutanten, die keine Lokomotionsmuster aus der Nahrung, z. B. tph-1 29 , verändern, sollten auch parallel ausgewertet werden, um sicherzustellen, dass die Kupfer- und Hungerbedingungen entsprechend kontrolliert werden. Darüber hinaus können, um den Beitrag des Hungers auf das ausgewertete Verhalten direkt hervorzuheben, auch separate Testbedingungen für zusätzliche Kontrollen entwickelt werden. Zum Beispiel können die Nematoden unmittelbar vor dem Assay verhungert und auf die Testplatte (mit Nahrung) übertragen werden, um zu ermitteln, wie schnell ein Organismus in einem ausgehungerten Zustand auf Kupfer reagiert und den Nahrungsmittelflecken erreicht. Unsere aktuellen Test-Highlights avErsive Reaktionen, da die experimentellen Organismen von einem gut gefütterten in den verhungerten Staat fortschreiten. Unser Assay ist eine Modifikation des häufig verwendeten C. elegans- Chemotaxis-Assays 4, bei dem ein stärkerer Stimulus ( dh hohe Konzentration) aufgenommen wurde, um Verhaltensweisen über einen längeren Zeitraum zu bewerten. Anstatt die momentanen Reaktionen zu bewerten, kann dieser Assay verwendet werden, um Veränderungen in aversiven Reaktionen zu messen, da Organismen in Richtung eines ausgehungerten Zustands fortschreiten (falls die notwendigen Kontrollen enthalten sind). Ähnliche Auswertungen in Abwesenheit von Kupfer zu bewerten , um Ethanolentzug Antworten, dh Nematoden Ortung Essen, im Laufe der Zeit wurden 24 verwendet. Wie bei jedem Verhaltenstest bei C. elegans ist die Kontrolle von Umgebungsvariablen für die Sicherstellung konsequent reproduzierbarer Ergebnisse unerlässlich. Organismen müssen alle gleich seinE, da die Verhaltensreaktionen mit dem Alter variieren können. Darüber hinaus kann die Variabilität des Ernährungszustandes der Würmer die Akklimatisierung der Hungerbedingungen verändern. Daher sollten die experimentellen Würmer nicht an irgendeinem Punkt vor diesem Protokoll verhungern. Hungersnot Erfahrung der elterlichen Generation kann auch beeinflussen Nachkommen Verhalten 30 ; Daher ist es ratsam, dafür zu sorgen, dass die experimentellen Organismen für mindestens zwei Generationen gut gefüttert werden. Darüber hinaus sollte die Anzahl der auf die Testplatten übertragenen Organismen konsistent bleiben, da die lokale Bevölkerungsdichte die Ausbreitungsraten beeinflussen kann 31 . Sobald Würmer auf die Platten übertragen worden sind, ist es entscheidend, die überschüssige M9-Lösung mit einem Laborgewebe zu entfernen, ohne die Agaroberfläche zu beschädigen. Eine Veränderung der Oberfläche kann mit spontanen Lokomotikmustern interferieren. Die überschüssige Lösung muss vor dem Beginn des offiziellen Startvorgangs entsprechend entfernt werdenDer Assay, um sicherzustellen, dass ein Thrashing-Verhalten, dh ein Nematoden-Lokomotixmuster, das in der Flüssigkeit beobachtet wird, nicht vorhanden ist. Ein klarer Indikator ist, nach dem Kriechverhalten zu suchen. Die Testplatten müssen so kontrolliert werden, dass die Platte und die bakterielle Trockenheit konsistent sind. Übermäßig frische Platten können Lokomotionsdefekte verursachen und können auch den Nachweis von Umwelteinflüssen beeinträchtigen 6 . Die Anwendung der Kupferlösungen muss so konsistent wie möglich sein, so dass aversive Barrieren in geeigneter Weise dick sind und sie nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommen. Die Anwendung zu wenig Kupferlösung könnte die wilde Art aversive Reaktionszeit vermindern, während zu viel die Trommeln für die Nematoden beweisen könnte. Das Zielen auf eine gleichmäßige Dicke der Kupferlösung ergibt die besten Ergebnisse. Wenn im Agar während der Kupferlösungsanwendung Vertiefungen entstehen, sollte die Testplatte verworfen werden. Würmer können durch solche Löcher hauen 32, Besonders wenn sie mit einer aversiven Substanz oder Hungersnot konfrontiert sind. Um die Plattengleichförmigkeit zwischen den Proben zu gewährleisten, konnten gemischte Populationen von Würmern ( dh ein Mutanten- und Wildtyp) auf der gleichen Platte gemessen werden, wenn man eindeutig markiert war ( z . B. über GFP). Obwohl dieser Assay auf Standard-Agarplatten durchgeführt wurde, können größere Platten verwendet werden ( z. B. 100 mm Durchmesser). In diesem Szenario sollte die Testdauer auf 6 Stunden verlängert werden, um genügend Zeit für die Wurmbewegung zu schaffen. Größere Platten könnten für die Prüfung von größeren Populationen und könnte verwendet werden, um zu untersuchen, wie Bevölkerungsdichte beeinflusst aversive Reaktionen über längere Zeiträume. Weiterhin technisch fortgeschrittene Verfahren könnten auch mit der Verwendung von Wurmverfolgungsgeräten verbunden sein, die mit einer beweglichen Stufe 33 gekoppelt sind. Die Wurmverfolgung würde genauere Messungen ermöglichen und die Erfassung zusätzlicher Variablen ermöglichen ( z </Em&gt; Frequenz, Umkehrfrequenz). Darüber hinaus würde die Datenerfassung kontinuierlich über die 4-Stunden-Periode aufgezeichnet, um eine genauere Zeitlinie des verhungerungsverhaltenen Verhaltens zu geben. Der Assay kann leicht angepasst werden, um die Messung alternativer Phänotypen zu ermöglichen. Das Alter des Wurms kann variiert werden, um Messungen über altersbedingte Hunger-induzierte aversive Veränderungen zu ermöglichen. Darüber hinaus könnten Variationen des Ernährungszustands der experimentellen Würmer auch eine Analyse der Gewöhnung des Verhungerns im Zusammenhang mit der Nahrung und der chemischen Abneigung ermöglichen. Solange Protokolle unter vergleichbaren Datensätzen konsistent sind, könnte nahezu jede Vorkonditionierung von experimentellen Organismen über den Chemotaxis-Assay ausgewertet werden.

Caenorhabditis elegans wurde als Modell für das Studium der Neurobiologie seit Jahrzehnten aufgrund der relativen Leichtigkeit bei der Analyse der Schaltungen eines Nervensystems aus nur 302 Neuronen 1 verwendet . Vorausgesetzt, dass der Organismus auf die Reaktion auf Umwelt-Cues angewiesen ist, ist ein Großteil des Nervensystems der Regulierung der Integration von Umweltsignalen gewidmet 2 . Trotz der Einfachheit seines Nervensystems kann C. elegans verschiedene Umweltsignale erkennen und darauf reagieren, einschließlich Repellents 3 , Lockstoffe 4 , Temperatur 5 und sogar Feuchtigkeit 6 . Ein nicht ordnungsgemäß Umweltsignale integrieren hat zu einer Reihe von Verhaltensstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Säugern Modellsystemen 7- 9 verbunden. Mit einer Reihe von verfügbaren neuralen Krankheit Modelle<html> 10 in C. elegans und die Entwicklung von Nematoden-Pharma-Bildschirmen 11 hat sich dieser Organismus als ein nützliches System für das Studium der Neurobiologie erwiesen. Angesichts der Verfügbarkeit eines abgebildeten Nematoden-Verbundes 1 und Mutationen für fast jedes Gen im Nematoden-Genom 12 ist unser Verständnis des Nematoden-Nervensystems und durch die Erweiterung unserer eigenen teilweise durch die Gestaltung von kreativ geeigneten Assays begrenzt. Eine Reihe von Chemotaxis-Assays wurden in den letzten 40 Jahren entwickelt, um die Nematoden-Ansprechempfindlichkeit auf verschiedene aversive Stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 zu bewerten. Initiale Experimente waren die Einführung eines akuten Umwelteinflusses, während ein einziger Wurm auf einer Agarplatte durchstreifte= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Sofortige Änderungen der Lokomotionsreaktionen wurden aufgezeichnet. Zum Beispiel kann der flüchtige Geruchsstoff Octanol auf ein Haar aufgetragen werden und vor einem Nematoden der Nase geweht 17 die Einleitung rückwärts Fortbewegung in Wildtyp - Würmern zu stimulieren. Komplexere Assays wurden auch entwickelt, um mehrere Variablen als Mittel zur Bewertung der Verhaltensauswahl zu integrieren 18 . Eine Variation dieses Assays beinhaltet die Verwendung einer Kupferlösung, um eine aversive Mittellinienbarriere 4 zu erzeugen. Ein Lockmittel, nämlich Diacetyl, wurde auf einer Seite der chemischen Barriere mit Würmern, die von der Diacetylquelle weg übertragen wurden, platziert. Würmer defekt für Kupfer aversive Reaktionen sofort über die Barriere, um das Diacetyl zu erreichen, während Wildtyp-Würmer wurden zunächst von der Barriere abgelehnt. Responses wurden erzielt, als Würmer zuerst die Kupferbarriere nähertenOhne langfristige Beobachtungen. Wenn Würmer ausgewertet werden nach Hungerbedingungen unterzogen, ihre Empfindlichkeit auf Umweltreize 19 verringert. Wenn das aversive chemische Octanol vor der Nematoden-Nase geweht wird, stimulieren Wildtyp-Organismen die Rückwärtsbewegung innerhalb von 3 - 5 s, wenn sie auf Nahrung sind. Nachdem diese Organismen 10 Minuten aus der Nahrung entfernt worden sind, zeigen sie eine verzögerte Reaktion von 8 - 10 s 20 . So zeigen Nematoden mit erhöhtem Hunger eine verminderte aversive Reaktion auf schädliche Umweltsignale, da die Suche nach Nahrung für das Überleben wesentlich wird. Umgekehrt reagieren Nematoden, die den Neuropeptidrezeptor 9 ( npr-9) überexprimieren , nicht auf Octanol auf oder aus der Nahrung und zeigen eine Unfähigkeit, auf eine Anzahl von aversiven Reizen zu reagieren 21 . Diese npr-9 (GF) -Organismen modulieren auch nicht ihre Umkehrfrequenz in Gegenwart von Nahrung, sondern könnenUmgekehrt als Reaktion auf harte Berührungsstimulationen, die darauf hinweisen, dass sie in der Lage sind, Rückwärts-Fortbewegung 21 zu machen . Wir haben auch npr-9 (LF) -Mutanten ausgewertet, da sie eine ungewöhnlich verminderte Umkehrfrequenz aus der Nahrung aufweisen und dennoch ihr Verhalten in Gegenwart von Nahrung modulieren können 21 . Die Kopplung des Ernährungszustandes des Wurms mit der Einführung akuter externer Reize hat bei der Aufklärung der Mechanismen unterstützt, mit denen ein lebensmittelbezogener Weg die sensorischen Signalwege 22 , 23 weitgehend modulieren kann. Die Anwesenheit von Speisen in der Nematodenumgebung wurde auch verwendet, um Ethanol-Entzugsantworten zu bewerten 24 . In diesem Experiment wurden die Würmer in unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol inkubiert und dann auf eine Agarplatte mit einem Nahrungsmittelfleck, das als &quot;Food-Race Assay&quot; bekannt war, platziert. Der Nahrungsmittelfleck wurde auf eine Kante der Platte gelegt, während die Nematoden wVon der Nahrungsquelle entfernt. Der Ethanolentzug wurde durch Messung der Zeitdauer gemessen, die für die Würmer benötigt wurde, um den Lebensmittelfleck zu erreichen. Dieser Nährstoff-basierte Kupfer-Aversion-Assay baut auf dem Food-Race-Assay auf, um zusätzliche Umgebungsvariablen, nämlich Nahrung und Kupfer, zu integrieren und dabei Verhaltensänderungen im Laufe der Zeit zu bewerten. Dies ist eine Anpassung eines gemeinnützigen Protokolls in der gesamten C. elegans- Gemeinschaft 4 . Dieses Protokoll wurde verwendet, um aversive Reaktionen und die Erkennung von Lebensmitteln über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten 21 . Da die Wurmaussetzveranstaltungen nach 30 min Nahrungsdeprivation 25 zeigen , können wir auch beurteilen, wie sich Veränderungen des Ernährungszustands auf Umweltreaktionen auswirken können. Die Bedingungen dieses Assays messen, wie experimentelle Organismen die Reaktionsfähigkeit auf aversive Stimuli im Laufe der Zeit verändern und damit Verhaltensänderungen bewertenOrganismen Fortschritte in Richtung eines ausgehungerten Zustandes (und fortgesetzte Messungen des verlängerten Hungers). Da die npr-9 (GF) Tiere ihr Verhalten nicht als Reaktion auf Nahrung oder viele aversive Cues verändern, haben wir versucht zu erkennen, ob diese Verhaltensdefizite im Kontext des Hungers bestehen würden. Letztlich wurde dieses Assay-Design formuliert, um die npr-9 (GF) -Mutanten spezifisch zu bewerten, sondern kann auch angepasst werden, um auch neue Stämme zu charakterisieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Um das Überleben zu sichern, müssen die Organismen in der Lage sein, ungünstige Lebensräume zu vermeiden und gleichzeitig eine gleichbleibende Nahrungsquelle zu gewährleisten. Caenorhabditis elegans verändern ihre Lokomotionsmuster bei der Erkennung diverser Umwelteinflüsse und können ihre Abhängigkeit von Verhaltensreaktionen als Reaktion auf Hungerbedingungen modulieren. Nematoden zeigen typischerweise eine verringerte aversive Antwort, wenn sie aus einer Nahrungsmittelquelle für mehr als 30 min entfernt werden. Die Beobachtung von Verhaltensänderungen in Reaktion auf einen sich ändernden Ernährungsstatus kann Einblick in die Mechanismen geben, die den Übergang von einem gut gefütterten in den verhungerten Zustand regeln. Wir haben einen Assay entwickelt, der die Fähigkeit eines Nematoden misst, eine aversive Barriere ( dh Kupfer) zu überqueren und dann über einen längeren Zeitraum eine Nahrungsquelle zu erreichen. Dieses Protokoll baut auf früheren Arbeiten auf, indem es mehrere Variablen in einer Weise integriert, die eine fortlaufende Datenerfassung ermöglicht, während sich die Organismen zu einemN zunehmend verhungert. Darüber hinaus erlaubt dieser Assay eine erhöhte Probengröße, so dass größere Populationen von Nematoden gleichzeitig ausgewertet werden können. Organismen, die für die Fähigkeit, Kupfer zu erkennen oder zu reagieren, sofort die chemische Barriere kreuzen, während Wildtyp-Nematoden anfänglich abgestoßen werden. Da Wildtyp-Würmer zunehmend verhungert sind, beginnen sie, die Barriere zu überqueren und die Nahrungsquelle zu erreichen. Wir haben diesen Assay entworfen, um eine Mutante zu bewerten, die nicht in der Lage ist, auf verschiedene Umwelt-Cues zu reagieren, einschließlich der Nahrungsmittelempfindung oder des Nachweises von aversiven Chemikalien. Wenn sie über dieses Protokoll ausgewertet wurden, überquerten die defekten Organismen sofort die Barriere, waren aber auch nicht in der Lage, eine Nahrungsmittelquelle zu detektieren. Daher kreuzen diese Mutanten wiederholt die chemische Barriere, obwohl sie vorübergehend eine Nahrungsquelle erreichen. Dieser Assay kann einfach die Populationen von Würmern testen, um mögliche Wegdefekte im Zusammenhang mit Abneigung und Hunger zu bewerten.

Wir nutzten Wildtyp (N2), npr-9 (tm1652) und einen npr-9- Überexpressionsstamm, dh npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), um Antworten auf Hunger und Kupferabwehr zu bewerten. Wildtyp-Organismen sind in der Lage, die aversive Kupferbarriere zu detektieren und zu reagieren, während npr-9 (GF) -Mutanten keine aversive Antwort auf das Kupfer über den 4 h-Assay 21 auslösen. Nach 30 min Verhungern überqueren etwa 50 - 60% der Wildtyp (N2) -Organismen die Kupferbarriere und erreichen das Nahrungsmittelpflaster. Bei der 2-h-Marke erreichen 75% der Wildtyp-Nematoden die Nahrungsquelle. Am Ende des Assays sind 100% der N2-Organismen in die Nahrungsquelle verlagert. Im Gegensatz dazu moduliert die Mehrheit der npr-9 (GF) -Organismen keine Lokomotionsmuster als Reaktion auf die Nahrung und wird auch weiterhin die aversive Barriere überqueren, auch wenn sie mit einer Nahrung in Berührung kommenQuelle. Die npr-9 (GF) -Würmer können ihre Fortbewegung in Reaktion auf Nahrung über den 4-h-Test ununterbrochen verändern und nur 30% der Testorganismen werden zu jeder Zeit auf dem Essen gefunden. Die npr-9 (LF) -Tiere führen nicht so gut wie N2-Organismen durch, sondern modulieren ihre Lokomotionsmuster, wenn der Hunger zunimmt, um den Nahrungsmittelflecken zu erreichen ( Abbildung 3 ). Wenn N2- oder npr-9 (LF) -Organismen über diesen Assay ohne Nahrung ausgewertet werden, überqueren sie selten die Kupferbarriere. Die npr-9 (GF) -Mutanten kreuzen wiederholt die Barriere hin und her ( Abbildung 4 ). <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Eine visuelle Darstellung von Markierungen, um eine Kupferlösungs-Platzierung auf der Unterseite eines 5-cm-Petrischalens anzuzeigen. Diese Indikationen werden verwendet, um sicherzustellen, dassDie Abschnitte der Platte wurden entsprechend gemessen und dienen als Leitlinie bei der Übertragung des Bakterienflecks und dann der Kupferlösung auf die Agaroberfläche. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55939/55939fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Der 5-cm-Petrischale wird in zwei Abschnitte für Ein-und Aus-Food-Assay-Platten aufgeteilt und ein Bakterien-Rasen wird in der Mitte eines dieser Sektionen für die On-Food-Platte geformt. Der Nahrungsmittelfleck sollte nicht mit der Testverbindung in Berührung kommen, die die Kanten der Platte leitet und eine Mittellinienbarriere bildet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55939/55939fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &lt;P class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig3.jpg" /> Abbildung 3 : Prozentsatz von N2, npr-9 (tm1652) und npr-9 (GF) Würmer, die die Nahrungsquelle über einen Zeitraum von vier Stunden in Reaktion auf den auf Nahrungsstatus basierenden Kupfer-Aversion-Assay erreichen. Datenpunkte sind Mittelwerte von mindestens drei Experimenten (n&gt; 30 Würmer), die an getrennten Tagen für beide Stämme durchgeführt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt und mit einer zweifachen wiederholten Maßnahme ANOVA analysiert. ** p &lt;0,01, signifikant verschieden von N2-Tieren unter identischen Bedingungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55939/55939fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55939/55939fig4.jpg" /> Abbildung 4 : Prozentsatz von N2, npr-9 (tm1652) und npr-9 (GF) W ormen, die die Kupferbarriere ohne Nahrungsquelle über einen vierstündigen Assay kreuzen. Die vorgenannten Stämme wurden hinsichtlich der Kupferabwehr in Abwesenheit von Nahrungsmitteln bewertet. Positive Reaktionen werden als Kreuzung der Kupferbarriere bewertet und verbleiben auf der Nicht-Ursprung-Hälfte der Platte. Datenpunkte sind Mittelwerte von mindestens drei Experimenten (n&gt; 30 Würmer), die an getrennten Tagen für beide Stämme durchgeführt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt und mindestens 10 Tiere wurden in drei unabhängigen Experimenten untersucht, die mit einem Zwei-Wege-wiederholten Maßnahmen ANOVA analysiert wurden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55939/55939fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

EIN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.4K Aufrufe.  Queen's University.  Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet. 

Serie: A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Ein Verhaltenstest für Mechanosensation der MARCM-basierte Klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Bildgebung dendritischer Dornen bei Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...