Este estudio fue apoyado por la investigación, desarrollo e innovación oficina de Hungría (grant 116912 a ÁH), la oficina de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE), el programa de becas beca Hungaricum (ayuda a ZM) y el nuevo Húngaro nacional excelencia Beca Predoctoral (grant EK).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ley de Bienestar Animal Húngaro.
1. preparación del reactivo
<ol><li>Soluciones madre<ol>
<li>Preparar 1 M trehalosa agregando 0,378 g de trehalosa dihidrato en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar 1 M sacarosa añadiendo 0,342 g de sacarosa en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar 1 M HEPES añadiendo 0,238 g de HEPES y 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar la colagenasa (290 U/mg) de 20 mg/mL mediante la adición de 100 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar tripsina 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) mediante la adición de 75 mg para 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar 1 mg/mL DNasa I (~ 3000 U/mg) mediante la adición de 5 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar tripano 0.4% azul mediante la adición de 40 mg de azul de tripano a 10 mL de PBS. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Alícuota 1 mL en tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Preparar 200 mg/L MS-222 (sulfonato de metano Metanosulfonato) mediante la adición de 200 mg de MS-222 en 1 L de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo. Además, el MS-222 tampón con bicarbonato de sodio a un pH neutro de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluciones de vitrificación<ol>
<li>Preparar la solución de equilibrado (ES): preparar 2 mL de CE mezclando 121.5 μl de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 μl de glicol de propileno (PG; 1,5 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de la solución madre de HEPES (25 mM) y 1208.5 μl de L-15 en un 2 tubo mL.</li>
		<li>Preparar la solución de vitrificación (VS): preparar 2 mL de VS mezclando 439 μl de PG (3 M), 426 μl de dimetilsulfóxido (Me2. 3 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de HEPES stock solución (25 mM) y 685 μl de L-15 en un tubo de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluciones para el calentamiento<ol>
<li>Preparar la solución calentamiento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 450 μl de solución de sacarosa (3 M) y 900 μl de L-15.</li>
		<li>Preparar la solución calentamiento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 150 μL de solución de sacarosa (1 M) y 1200 μl de L-15.</li>
		<li>Preparar solución calentamiento 3 (WS3): preparar mezcla 150 μL FBS (10%) 1.5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL y μl de 1350 de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de digestión: para cada muestra preparar 500 μl de la solución de digestión mezclando 50 μl de la solución madre de colagenasa (2 mg/mL), 50 μl de la solución madre de tripsina (1,5 mg/mL), 10 μl de DNasa I (20 μg/mL) y 390 μl de L-15 en 2 mL del tubo.</li>
	<li>Obtener herramientas de disección: tijeras, microscissors, pinzas, pinzas curvas y agujas de acupuntura.</li>
</ol>2. testículos colección
<ol><li>Eutanasia a los peces colocando en un recipiente que contiene 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Antes de continuar con la disección, asegúrese de que las branquias han detenido y por lo menos 10 minutos han pasado desde ese momento para asegurar la muerte por hipoxia.</li>
	<li>El pescado seco acariciando sobre una toalla de papel y colóquela sobre su lado dorsal en una estera de la disección.<ol>
<li>En primer lugar cortar las aletas pélvicas y pectorales para la disección más fácil.</li>
		<li>Horizontal, cortar la piel en el vientre de los peces entre las aletas pectorales y cortar la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre hasta la aleta anal.</li>
		<li>Abra la cavidad del cuerpo de los peces y la clavija de la pared izquierda y derecha del cuerpo a la estera de la disección con agujas. Nota: Los testículos se encuentran por encima de los órganos gastrointestinales en ambos lados de la vejiga natatoria (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar la contaminación, no sacar los órganos gastrointestinales, pero suavemente empuje hacia un lado y quitar el testículo del lado opuesto. Los testículos están conectados con la pared del cuerpo así que quitarlos con cuidado y cortar el peritoneo de conexión por microscissors.</li>
	<li>Además, con el fin de evitar la contaminación, en primer lugar esterilizar los testículos poniendo en etanol al 70% durante 2 s y entonces lugar ellos en L-15 en una placa de 96 pozos en el hielo. Nota: Si es necesario, limpiamos testículos grandes y del tejido adiposo vasos sanguíneos precisamente bajo el estereomicroscopio</li>
</ol>3. ultra rápido enfriamiento del tejido Testicular
<ol><li>Agujas de marca con etiquetas apropiadas dependiendo de la muestra tipo y preparan las soluciones de vitrificación (VS) y equilibrado (ES).</li>
	<li>Transferir los testículos a una placa bien grande o plato y perno de dos a tres los testículos (o más dependiendo del tamaño de la aguja) en una aguja de acupuntura estériles.<ol>
<li>En primer lugar colocar el testículo en la parte superior curva pinzas. Coloque la punta de la aguja en el centro del testículo y tire cuidadosamente el testículo hacia arriba con las pinzas.</li>
		<li>Después de pinchar los testículos, con cuidado tirar hacia arriba hacia la parte superior de la aguja. Asegúrese de que los testículos están separados unos de otros y que no son caerse o deslizarse.</li>
		<li>Lugar las agujas con testículos anclados en un tubo de 2 mL con L-15 hasta vitrificación (a 25 ° c; tiempo de almacenamiento no debe exceder 1 h). Nota: La fijación de los testículos en la aguja debe hacerse rápidamente para impedir que los testículos se sequen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir la aguja con los testículos en la solución de equilibrado e incubar durante 5 min a 25 °.</li>
	<li>La aguja de transferencia en la solución de vitrificación e incube durante 30 s a 25 °.</li>
	<li>Retire la aguja de la solución de vitrificación, suavemente y rápidamente absorben el resto de la solución en el tejido por una toalla de papel estéril. Tenga cuidado para evitar los testículos pegarse a la toalla de papel o caerse.</li>
	<li>Rápidamente Coloque la aguja en nitrógeno líquido colocada en una caja de espuma de poliestireno. Nota: Hacer este paso rápidamente para evitar la exposición del tejido a los vapores de nitrógeno líquido. Utilizar volúmenes bajos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de las muestras.</li>
	<li>Mantener la aguja en nitrógeno líquido en una caja cerrada de la espuma de poliestireno de 5-10 minutos.</li>
	<li>Preenfriar un criotubo abierto 4,5 mL y su tapa en la misma caja.</li>
	<li>Después de 5-10 min, transferir cada aguja en un criotubo separado debajo de la superficie de nitrógeno líquido y cerrar el criotubo. PRECAUCIÓN: Siempre use ropa protectora (tales como guantes aislados) cuando trabajo con nitrógeno líquido como exposición puede llevar a congelación severa.</li>
	<li>Coloque el criotubo en un bastón de metal y coloque en el recipiente de cryobank tan rápido como sea posible. Almacenar las muestras en un almacenamiento de información de vaso dewar hasta su uso posterior.</li>
</ol>4. procedimiento de calentamiento
<ol><li>Caliente cada aguja por separado. Todas las soluciones de calentamiento deben ser a 25 ° C.</li>
	<li>Separar el criotubo de la caña de metal y sumergirse en nitrógeno líquido, almacenado en una caja de espuma de poliestireno.</li>
	<li>Abrir el criotubo en el vapor del nitrógeno líquido (con pinzas) y suelte la aguja en el nitrógeno líquido.</li>
	<li>Transferir la aguja muy rápido en la primera solución calentamiento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Asegúrese de transferir la aguja rápidamente para evitar su calentamiento en el aire durante la transferencia.</li>
	<li>Transferencia de la aguja en la segunda solución calentamiento e incubar durante 3 minutos (a 25 ° C).</li>
	<li>Transferencia de la aguja en la tercera solución calentamiento e incubar durante 5 minutos (a 25 ° C).</li>
	<li>Liberar los testículos de la aguja deslizándolo hacia abajo con una pinza curva. Lugar cada testículo calentado individualmente en un pozo independiente (placa de 96 pocillos) con 250 μl de L-15 suplementado con 10% FBS. Asegúrese de que los pozos están etiquetados según la muestra. Mantenga la placa bien en el hielo hasta que todas las muestras se calientan y hasta más trabajo.</li>
</ol>5. tejido digestión
<ol><li>Preparar 500 μl de la solución de disociación para cada muestra en tubos separados 2 mL. Etiquetar los tubos de acuerdo con el código de la muestra. Incubar la solución preparada de disociación por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir el tejido calentado en la solución de digestión y cortar en trozos pequeños por lo menos 30 movimientos de tijeras pequeñas.</li>
	<li>Incubar el tejido cortado en una placa de agitación durante 90 minutos a 25 ° c.</li>
	<li>Detener el proceso de digestión mediante la adición de 400 μL de L-15 y 100 μl de FBS (SFB 10% v/v). Brevemente agitar la solución e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtrar la solución obtenida a través de 50 filtros del μm en un tubo de 1,5 mL. Etiquetar los tubos por consiguiente.</li>
	<li>Centrifugue la solución filtrada a 200 x g durante 10 min a 25 ° c.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 μl de L15 suplementado con 10% FBS. Agitar manualmente el tubo hasta que el precipitado se haya disuelto completamente. Mantener la suspensión de células en hielo o a 4 ° c hasta su uso posterior.</li>
</ol>6. viabilidad evaluación y recuento celular
<ol><li>Mezcla 5 μl de suspensión celular y 5 μl de solución de azul de tripano 0.4% en un tubo PCR de 0.2 mL debidamente etiquetado. Si se utilizan volúmenes diferentes, asegúrese de que la relación de dilución de 1:1 restos.</li>
	<li>Incubar la suspensión de 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Comprobar la viabilidad de cada muestra en un hemocitómetro bajo el microscopio.</li>
	<li>Contar el número de células vivas (sin mancha de azul tripán) en 15 campos. Calcular el número total de células de 20 μm de la suspensión de células. La suspensión está lista para cualquier aplicación posterior. Nota: Cuando optimizar el procedimiento para otras especies con tamaño de cuerpo más grande, utilizar fragmentos de testículos de igual peso. Utilice los testículos de un individuo para todos los grupos experimentales con el fin de evitar la variabilidad individual en los resultados. En el caso del pez cebra, aprovechamos el hecho de que izquierda y testículo derecho debe contener un número igual (o muy similar) de las células germinales13 (véase los resultados de representante). El testículo izquierdo se mantuvo como un control, mientras que el testículo derecho era vitrificados/calentados. Porcentaje de viabilidad se calculó el número de células aisladas del testículo vitrificados/calentados en comparación con el número de células aisladas de los testículos frescos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de enfriamiento ultra rápido desarrollado para especies de aves y mamíferos10,11,12 a la crioconservación de testículo de pez (pez cebra como modelo organismo). La mayoría de los estudios anteriores con respecto a la criopreservación de los recursos genéticos del pez cebra se centraron principalmente en criopreservación de esperma de pez ...

Nuevas tendencias en la ciencia y la biotecnología han llevado a la creación de miles de nuevas líneas mutantes de Drosophila, pez cebra, ratones y otras especies usadas como organismos modelo en biomedicina y otras ciencias1. Además, como nuevas tecnologías se desarrollan y se convierten en disponibles, los números de líneas mutantes aumentan constantemente2. Esto conduce a la necesidad de un almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. Como un método que permite el almacenamiento seguro de los recursos genéticos por un período indefinido de tiempo, criopreservación ofrece muchas ventajas tales como extensión de la temporada reproductiva, evita la necesidad de un mantenimiento continuo de los reproductores, y es más costo - y mano de obra eficiente2.
Protocolos de criopreservación de esperma desarrollado durante los últimos varios años2,3,4 ofrecen la oportunidad para el almacenaje acertado del material genético masculino de pez cebra. Sin embargo, la criopreservación de óvulos o embriones de peces todavía no es posible debido a su compleja estructura y grandes cantidades de material de la yema de huevo. Recientemente, la práctica del trasplante de células de germen primordiales (PGCs) o las células madre espermatogonias (SSCs) ofrece un puente a esta barrera mediante el desarrollo funcional de la esperma y huevos después de trasplante5. Por lo tanto, la criopreservación de SSCs ofrece una nueva frontera en la conservación de los recursos genéticos raros y valiosos.
A pesar de que la criopreservación ofrece muchas ventajas, el proceso de congelación lenta tasa genera varias condiciones que pueden llevar a daño de la célula2. Estos incluyen la formación de hielo intracelular y extracelular, deshidratación y toxicidad del crioprotector. Hielo daña las células, hielo extracelular puede conducir a trituración mecánica de las células, mientras que la difusión de agua desde las células durante la tasa lenta de congelación puede conducir a deshidratación6. Recientemente, se ha aplicado vitrificación como una técnica que evita los efectos negativos de la formación de hielo en la criopreservación de gametos de peces7,8,9. Presenta una técnica de enfriamiento ultra rápida a través del cual los medios de comunicación internos y externos se convierten en un estado amorfo/vidrioso sin crystalizing en hielo7,10. Éxito vitrificación de tejido ovárico y testicular ha sido evidenciado en especies de aves y mamíferos10,11,12, abriendo posibilidades para su aplicación en los peces, así.
En este estudio, presentamos el procedimiento de vitrificación (NIV) aguja sumergido para la criopreservación de los testículos todo pez cebra. Demostrar un método confiable para el aislamiento de las células de germen incipiente pez cebra sin contaminación y un proceso de criopreservación que produce cantidades relativamente altas de células de germen incipiente con una baja presencia de otras células, especialmente de espermatozoides. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en demostrar un protocolo detallado visualizado para el enfriamiento ultra rápido de tejido gonadal de peces y pez cebra del germline células. Además, la repetibilidad del método se demuestra en cinco cepas diferentes de pez cebra: AB tipo salvaje, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] y línea transgénica de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Leibovitz media (L-15)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">L1518</td>
			<td style="width:296px;">Supplemented with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F9665</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">H3375</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Sucrose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trehalose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>99-20-7</td>
			<td style="width:296px;">Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Methanol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">20740-0-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Propylene glycol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">08860-1-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">00190-1-01-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Collagenase</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:200px;">9001-12-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8003</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">DNase I</td>
			<td style="width:220px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:200px;">A3778</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T6146</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

Tendencias actuales en ciencia y biotecnología conducen a la creación de miles de nuevas líneas en organismos modelo lo lleva a la necesidad de nuevos métodos para el almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Criopreservación de células de germen incipiente por los testículos todo NIV ofrece posibilidades para el almacenamiento de pez cebra recursos genéticos, especialmente puesto que después maduran a gametos masculinos y femeninos. Los testículos fueron suprimidos, en una aguja de acupuntura, equilibrada en dos medios crioprotectores (solución de equilibrado que contiene 1,5 M metanol y glicol de propileno de 1.5 M; y solución de vitrificación que contiene dimetilsulfóxido de 3 M y 3 M propilenglicol) y sumergida en nitrógeno líquido. Las muestras fueron calentadas en una serie de tres soluciones de calentamiento consiguientes. Las principales ventajas de esta técnica son (1) la falta de espermatozoides después de la digestión de los testículos caliente facilitando manipulaciones posteriores; (2) ultra rápido de enfriamiento que permite la óptima exposición de los tejidos a nitrógeno líquido, por lo tanto maximizar la refrigeración y reducir la necesaria concentración de crioprotectores, reduciendo así su toxicidad; (3) exposición sincrónica de varios testículos crioprotectores y nitrógeno líquido; y repetibilidad (4) demostró mediante la obtención de la viabilidad de sobre el 50% en cinco cepas diferentes de pez cebra.

En promedio, el número de células de germen inicial aislada de un testículo de pez cebra dulce solo varió entre 40.000 y 200.000 células dependiendo del tamaño de los peces. Al digerir los testículos frescos de pez cebra en todas las 5 cepas, células germinales tempranas no eran las células sólo presentes en las suspensiones de la célula (figura 2). Al lado de las células de germen incipiente, numerosos espermatozoides fueron encontrados también....

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.2K vistas.  Szent István University. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Hacer pez cebra Gynogenetic diploides por presión inicial

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Los centrosomas de imagen en Fly Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...