Name: maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia
Uploaded: 2017-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
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Reconocemos Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina y Clare Doig por sus contribuciones al desarrollo de nuestros métodos de mantenimiento de la Colonia y Johnson tres revisores anónimos por sus sugerencias que ayudaron a mejorar el manuscrito. Nuestra investigación es apoyada por un programa de subvención y beca de AAH del nacional salud y donación de Consejo de investigación médica y una traducción de la Wellcome Trust. PAR es un recipiente de un australiano gobierno investigación beca programa de formación.

Sangre alimentación de los mosquitos en seres humanos fue aprobada por la Universidad de Melbourne Comité de ética humana (aprobación #: 0723847). Todos los voluntarios siempre informaron consentimiento.
1. larvas de crianza
Nota: Los mosquitos se llevan a cabo en 26 ± 0,5 ° C y 50-70% de humedad relativa, con un fotoperiodo de 12:12 h (luz: obscuridad) para este protocolo de mantenimiento de la Colonia. Estas condiciones son similares a las condiciones climáticas promedio en Cairns, Australia y dentro del rango térmico óptimo para la supervivencia de Ae. aegypti y desarrollo44,45,46. Altas temperaturas pueden resultar en la pérdida de colonias de mosquitos Wolbachia infecciones y deben ser evitada47. Mantener a por lo menos 500 individuos por población para minimizar la endogamia; mantenimiento de colonias de un tamaño más pequeño puede tener consecuencias de fitness [Ross et al. no publicado]. Bajo estas condiciones y suponiendo que una nutrición adecuada, el tiempo de generación promedio es de 28 días (ver tabla 1).
<ol><li>Sumergir los huevos en el sustrato en bandejas (figura 1A) que contiene 3 L de agua (agua de ósmosis inversa de agua, generado por dejar agua en bandejas para 24 h antes de su uso), ~ 300 mg de alimento para peces (uno aplastado comprimidos, véase Tabla de materiales) y un pocos granos de levadura seca activa para inducir incubar48.</li>
	<li>Un día después de la eclosión, utilice una pipeta de vidrio para transferir aproximadamente 500 larvas a bandejas que contiene 4 L de agua (figura 1B), cuenta con un contador de clicker. Añadir dos tabletas de alimento de pescado picado a cada bandeja. Si es necesario, utilizar recipientes de diferentes tamaños para la cría de las larvas (figura 1A), pero mantener densidades larvales por debajo de 0.5 larvas/mL para evitar el hacinamiento.</li>
	<li>Verifique las bandejas diariamente para asegurar que las larvas tengan alimento suficiente; Añadir aproximadamente dos tabletas de alimento a las bandejas cada dos días. Proporciona alimento ad libitum pero asegurar que 0.5 mg/larva/día está disponible durante este período para asegurar desarrollo es sincrónico y tamaño del cuerpo es constante, de lo contrario se pueden confundir los resultados de experimentos (ver resultados de representante).</li>
	<li>Tenga cuidado para evitar la sobrealimentación de larvas, particularmente en recipientes más pequeños cría con agua menos volumen y superficie. Si el agua se ve turbio o si existe significativa mortalidad larvaria, reemplazarlo con agua fresca; la mortalidad debe ser despreciable si las larvas se alimentan de forma óptima.</li>
</ol>2. adulto aparición
Nota: Larvas empiezan a pupar de cinco días después de la eclosión si bien alimentados y la mayoría debe pupate por siete días después de la eclosión. Adultos comenzará a emerger aproximadamente dos días después de la pupación si mantiene óptimo en 26 º C (ver Resultados de representante). Desarrollo larvario está normalmente afectado por infecciones de Wolbachia cuando se proporciona abundante comida23,39,49.
<ol><li>Siete días después de la eclosión vierta todo el contenido de la bandeja a través de una malla fina (0,4 mm de tamaño de poro). Guardar el agua filtrada de larvas para su uso posterior en ovicups (vea la sección "Alimentación y oviposición de la sangre"). Invierta la malla y sumergirla en un recipiente de plástico con 200 mL de agua para transferir las pupas. Proporcionar alimento adicional si cualquier larvas permanecen.</li>
	<li>Suministro de dos tazas de solución de sacarosa al 10% (Figura 1F) y dos tazas de algodón húmedo para evitar la desecación (Figura 1E) para preparar las jaulas de aparición adulta (figura 1).</li>
	<li>Si no necesita las pupas clasificar por sexo, coloque los envases con tapa de pupas en la jaula y deje la tapa ligeramente abierta para permitir que los adultos que emergen en la jaula. Como alternativa, colocar un embudo invertido sobre el recipiente para minimizar el ahogamiento. Asegúrese de que todos los adultos han surgido antes de retirar el recipiente de la jaula para evitar la selección contra desarrolladores lento.</li>
</ol>3. pupa de sexado para cruzamiento exogámico
<ol><li>Si las pupas tienen que clasificar por sexo (p. ej., para la exogamia), pipetear las pupas de bandejas de larvas y separar los sexos (figura 2) en envases de plástico (figura 1A) con 200 mL de agua cada 24 h hasta el número deseado de cada sexo se ha llegado. Coloque las tapas de los envases y dejarlos cerrados.</li>
	<li>Adultos surgirán en los envases; confirmar su sexo antes de soltar en jaulas (figura 2). Retire a cualquier adultos sexuados incorrectamente con un aspirador dentro de 24 h de aparición antes de que alcancen la madurez sexual. Una vez estén confirmados los sexos, liberar a los adultos en jaulas cada 24 h.</li>
	<li>
Para obtener la Wolbachia-outcross colonias infectadas de un fondo genético similar a un natural de la población, mediante la adición de Wolbachia-infectados hembras de colonias de laboratorio a las jaulas de los machos no infectadas derivados de huevos recogidos por ovitraps en el campo39, manteniendo la densidad prescrita de 500 individuos por población.
	<ol>
<li>Repita la exogamia para que por lo menos tres generaciones consecutivas producir colonias que son similar genéticamente a la población de campo39menos de 87.5%. Crítica: Asegurarse de que los sexos son correctos en esta etapa (ver paso 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hembra de Ae. aegypti son generalmente refractarios a otra inseminación dentro de horas del apareamiento50. Cuando exogamia colonias, permitir que las hembras y machos maduran en jaulas separadas durante dos días y luego aspirar las hembras en la jaula del macho proporcionar igualdad de oportunidades a todos los varones.</li>
</ol>4. sangre de alimentación y oviposición
<ol><li>
Espere por lo menos tres días después de la última hembra surgió antes de sangre alimentación para permitir suficiente tiempo madurar. Sangre alimenta a las hembras dentro de dos semanas de emergencia para prevenir la mortalidad excesiva, particularmente para los mosquitos con infecciones de Wolbachia que afectar longevidad22,24,49. Retirar las tazas de azúcar el día antes de la alimentación para mejorar las tasas de alimentación.
	<ol>
<li>Pedir un voluntario para insertar su antebrazo en la jaula para permitir que los mosquitos femeninos alimentar. Mayoría de las hembras debe alimentar a saciedad dentro de 5 minutos, pero para reducir la selección contra alimentadores lento, dejar el antebrazo en la jaula durante 15 min, o hasta que todas las hembras están visiblemente engorged; un guante de látex para proteger la mano de las mordeduras es opcional pero recomendado.</li>
		<li>Dos días después de alimentarse de la sangre, colocar dos vasos de plástico que contiene agua de cría larval y forrado con una tira de papel de lija (figura 1) (o papel de filtro (figura 1 H)) en la jaula de las hembras a desovar. Parcialmente se sumerja la tira de papel de lija en el agua para mantenerlo húmedo. Eliminar otras fuentes de agua para evitar que las hembras pongan sus huevos fuera de la Copa de la oviposición. Nota: agua del grifo se puede utilizar en las tazas, pero fomenta la cría de larvas agua oviposición51,52 y las hembras pondrán sus huevos más síncrono.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. huevo recogida y acondicionamiento
<ol><li>Las hembras desovan en el papel de lija por encima de la línea de agua; recoger y reemplazar las tiras de papel de lija diariamente hasta que no se colocan más huevos. Tenga en cuenta que oviposición puede continuar por hasta una semana.</li>
	<li>Tiras de lija parcialmente seca frotando suavemente los sobre una toalla de papel para 30 s, teniendo cuidado de no para desalojar los huevos. Luego, envuelva las tiras en una hoja de toalla de papel y colóquelo en una bolsa de plástico sellable (figura 1I).</li>
	<li>Compruebe el estado de los huevos con un microscopio de disección (figura 3). Si tiras el papel de lija está demasiado húmedo, pueden eclosión de los huevos antes de ser sumergida en agua (figura 3B), pero si seca demasiado duramente, huevos pueden colapsar (figura 3).</li>
	<li>Los huevos pueden ser rayitas en cualquier momento más allá de la colección después de tres días; eclosionan todos los huevos de cada colonia, recogidos a través de todos los días, en el mismo contenedor de agua para asegurar que la próxima generación se muestrea de una piscina grande, al azar de los individuos.</li>
	<li>Para el almacenamiento a largo plazo, mantener los huevos en un recipiente cerrado a una humedad alta (> 80%) en alrededor de 20 ° C. En estas condiciones, huevos sin Wolbachia pueden almacenarse durante varios meses manteniendo alta Portilla tarifas53,54.</li>
	<li>Como algunas infecciones de Wolbachia reducen enormemente la viabilidad de huevos de edad49,55, eclosionan los huevos de Wolbachia-infectados líneas dentro de una semana de la colección para evitar la mortalidad excesiva de los cepas. Sangre alimenta a las hembras otra vez después de una semana si se necesitan huevos.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Día</td>
			<td colspan="3">Paso</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Huevos de Portilla</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Conteo de larvas en las bandejas</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Transferencia de larvas y pupas a jaulas de Colonia</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Alimentación de hembras adultas de la sangre</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Comenzar a colectar huevos</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Final, recolección de huevos</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Huevos de Portilla</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen del programa de mantenimiento de Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. La sincronización de la hembra alimentan de sangre y la eclosión de los huevos es flexible, pero deben evitarse largas duraciones en estas etapas, particularmente para los mosquitos infectados con Wolbachia, con el fin de minimizar la mortalidad. Siguiendo este esquema minimiza la selección contra los mosquitos que son rápidos o lentos para desarrollar y madurar en todas las etapas de la vida, siempre y cuando las larvas se alimentan de óptimo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Figura 1: Equipo utilizado para la cría de Ae. aegypti en el laboratorio. (A) envases de plástico utilizados para huevos para incubar o criar larvas con cantidades de 500, 750 y 5.000 mL (de izquierda a derecha). (B) bandejas usadas para la cría de larvas en una densidad controlada, generalmente de 500 larvas en 4 L de agua. (C) 19.7 L y (D) L 3 jaulas utilizados para los adultos de la vivienda. Una densidad de adultos de 25 o menos por litro debe ser mantenido para proporcionar suficiente espacio. (E) taza de 35 mL con algodón húmedo proporcionado como una fuente de agua para adultos. (F) taza de 35 mL con solución de sacarosa proporcionada a través de un cable o mecha dental como una fuente de azúcar. (G–H) Tazas con agua de cría larval y alineado con un sustrato de oviposición de papel de lija o papel de filtro (G y H, respectivamente). () Cierre de cremallera bolsa para almacenamiento de las tiras de papel de lija o papel de filtro. Puntos negros en la papel de lija son huevos de mosquito. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Figura 2: Lateral (A) y dorsales (B) vistas de pupas y adultos Ae. aegypti (C) demostrar su dimorfismo sexual. Los machos se colocan a la izquierda y las hembras a la derecha de cada panel. Cuando se alimenta óptimamente, pupas de machos y hembras se diferencian por tamaño; las hembras son más grandes que los machos (A) y tienen un cefalotórax con bulbo relativamente en comparación con los machos que tienen caras planas (B). Adultos masculinos se distinguen fácilmente de las hembras en todas las condiciones de cría, sobre todo por sus antenas plumosos y largos palpos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Figura 3. Cuatro días de edad huevos de Ae. aegypti en condiciones diferentes. Intactos (A) huevos en tiras de papel de lija, mantenidas a una humedad alta (> 80%) pero sin ninguna humedad visible. Tipos de Hatch deben ser sobre el 90% de tipo salvaje Ae. aegypti si mantiene correctamente. (B) huevos que eclosionan antes de ser sumergida en agua (eclosión precoz) se distinguen por una tapa de huevo individual y visible de la larva. Esto indica que la tira de papel de lija se mantiene demasiado húmeda. Huevos (C) que se secan demasiado severamente pueden colapsar y son claramente visibles por su apariencia cóncava. Si la lija se convierte en rígido también indica que los huevos sean demasiado secos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Siguiendo el protocolo que presentamos para el mantenimiento de Wolbachia-infectados Ae. aegypti deben garantizar que los mosquitos sanos de una calidad constante se producen para los experimentos y abren notas de campo. A diferencia de otros protocolos que prioricen la producción de grandes cantidades de mosquitos (véase la referencia57), los métodos se centran en maximizar su aptitud, tanto dentro de las generaciones mediante la implementación de las condiciones de cría re...

Los mosquitos Aedes aegypti son responsables para la transmisión de los arbovirus más importantes del mundo, incluyendo dengue, Zika y chikungunya1. Estos virus se están convirtiendo en una amenaza creciente para la salud global, como la distribución generalizada de Ae. aegypti en las zonas tropicales continúa ampliando2,3,4. Hembra de Ae. aegypti preferentemente se alimentan de sangre humana5 y así tienden a vivir en proximidad cercana a los seres humanos, particularmente en las zonas urbanas donde las poblaciones son más densas. A través de esta asociación cercana con los seres humanos también se han adaptado para reproducirse en ambientes artificiales, como neumáticos, macetas, canaletas y tanques de agua6,7. AE. aegypti también fácilmente adaptarse a entornos de laboratorio donde se puede mantener sin cualquier requisito especial después de ser recogido directamente en el campo, a diferencia de algunas otras especies de Aedes género8, 9,10. Su facilidad de mantenimiento ha visto ampliamente estudiado en el laboratorio en una amplia gama de campos, en última instancia, con el objetivo de controlar los mosquitos de enfermedades puede transmitir.
Tradicionalmente, control por arbovirus depende en gran medida el uso de insecticidas para reducir poblaciones de mosquitos. Sin embargo, hay creciente interés en los enfoques donde los mosquitos modificados son criados en el laboratorio y luego liberados en las poblaciones naturales. Los mosquitos liberados pueden modificarse genéticamente11,12,13, biológicamente14,15, a través de irradiación16, tratamiento químico17,18, o combinación de técnicas19 para suprimir las poblaciones de mosquitos o reemplazarlos con los mosquitos que son refractarios a transmisión arboviral20.
Wolbachia son bacterias que se utilizan actualmente como un agente de control biológico para arbovirus. Varias cepas de Wolbachia se introdujeron recientemente en Ae. aegypti experimentalmente usando microinjection embrionario21,22,23,24. Estas cepas reducen la capacidad de arbovirus a difundir y replicar en el mosquito, disminuyendo su transmisión potencial23,25,26,27,28 . Wolbachia infecciones se transmiten de madre a hijos, sin embargo algunas cepas inducen esterilidad cuando los machos infectados aparean con las hembras no infectadas22. Wolbachia-varones infectados por lo tanto pueden ser lanzados en grandes cantidades para suprimir las poblaciones de mosquitos naturales, recientemente demostradas en otras especies de Aedes 15,29. Sin embargo, puesto que Wolbachia también inhiben la transmisión arboviral en Ae. aegypti, mosquitos pueden también lanzar para reemplazar las poblaciones nativas con vectores más pobres. Ae. aegypti infectado experimentalmente con Wolbachia ahora están siendo liberados en el campo en varios países con este último enfoque14,30,31.
Wolbachia-basada en enfoques de control arboviral dependen de una sólida comprensión de las interacciones entre Wolbachia, el mosquito y el medio ambiente. Wolbachia ocurre naturalmente en una amplia gama de insectos, y las tensiones que introducen los mosquitos son diversas en sus efectos32. Como se introducen nuevos tipos de infección por Wolbachia en Ae. aegypti24, es necesario caracterizar cada cepa por sus efectos en la aptitud de mosquito, reproducción y arboviral interferencia en una variedad de condiciones. Experimentación rigurosa en el laboratorio, por tanto, es necesaria para evaluar el potencial de las cepas de Wolbachia tener éxito en el campo.
Notas de campo abierto de Ae. aegypti con Wolbachia infecciones a menudo pueden requerir miles a decenas de miles de mosquitos por la zona de lanzamiento para ser criaban cada semana14,30,31. El éxito de los lanzamientos iniciales puede mejorarse liberando mosquitos de gran tamaño para maximizar su fecundidad33 y acoplamiento éxito34,35. Los mosquitos también deben ser adaptados a las condiciones que se experimentan en el campo, cría de laboratorio sin embargo a largo plazo puede causar cambios en comportamiento y fisiología que podría afectar el campo rendimiento36,37, 38.
Se describe un protocolo simple para la cría de Ae. aegypti en el laboratorio utilizando equipamiento básico. Este protocolo es conveniente para ambos tipo de salvaje y Wolbachia-infectados por mosquitos, que puede requerir especial atención ya que algunas cepas de Wolbachia tienen efectos sustanciales sobre la historia de la vida rasgos de mosquito39, 40. las condiciones de cría evitar el hacinamiento y la competencia por el alimento producir mosquitos de tamaño constante, que es crítica para la competencia de vector y los experimentos de fitness y asegura que los mosquitos son saludables para el lanzamiento de campo41 . También tomamos precauciones para minimizar la adaptación del laboratorio y la endogamia mediante la reducción de presiones selectivas y asegurándose de que la próxima generación se muestrea de una piscina grande, al azar. Sin embargo, los entornos de laboratorio son claramente diferentes de las condiciones de campo, y mantenimiento a largo plazo en condiciones relajadas podría reducir la capacidad de los mosquitos al soltar en el campo37,42,43 . Por lo tanto cruzamos las hembras de líneas de laboratorio al campo los hombres periódicamente, dando lugar a colonias que son genéticamente similares comparaciones experimentales y que se adaptan a la meta de población campo39. Los métodos no requieren de ningún equipo especializado y pueden ampliarse a posterior decenas de miles de personas por semana para los lanzamientos de campo. El protocolo también da prioridad a la aptitud de mosquitos dentro y a través de generaciones, una consideración importante para los insectos destinados al establecimiento de las poblaciones naturales. El protocolo es conveniente para la mayoría de los laboratorios que requieren mantenimiento de Ae. aegypti, especialmente para las comparaciones experimentales donde una calidad constante de los mosquitos y relatability al campo son importantes.

<table><tbody><tr><td>Wild type &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; Mel-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Walker and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;23&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; AlbB-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Xi and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;21&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; MelPop-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;22&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>Instant dried yeast</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used</td></tr><tr><td>5 L plastic tub</td><td>Quadrant</td><td>Q110950</td><td>Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used</td></tr><tr><td>Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td></td><td></td><td>Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td></td><td></td><td>Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Clicker counter</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Rearing trays</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td></td><td></td><td>Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Cages</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup lid</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Cotton wool</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used</td></tr><tr><td>White Sugar</td><td></td><td></td><td>Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores</td></tr><tr><td>Rope</td><td>M Recht Accessories</td><td>C323C/W</td><td>Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr><tr><td>Plastic cup (large)</td><td></td><td></td><td>Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable</td></tr><tr><td>Sandpaper</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia

Los mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente con Wolbachia se están utilizando en los programas para controlar la propagación de arbovirus como el dengue, el chikungunya y Zika. Wolbachia-mosquitos infectados pueden ser lanzados en el campo o bien reducir el tamaño de la población a través de cruzamientos incompatibles o transformar las poblaciones de mosquitos que son refractarios a la transmisión del virus. Para que estas estrategias tener éxito, los mosquitos liberados en el campo del laboratorio deben ser competitivos con los mosquitos nativos. Sin embargo, mantener los mosquitos en el laboratorio resulta en endogamia, deriva genética y adaptación de laboratorio que puede reducir su aptitud en el campo y puede confundir los resultados de experimentos. Para probar la idoneidad de diferentes infecciones de Wolbachia para el despliegue en el campo, es necesario mantener los mosquitos en un entorno de laboratorio controlado a través de múltiples generaciones. Se describe un protocolo simple para mantener los mosquitos Ae. aegypti en el laboratorio, que es conveniente para ambos Wolbachia-mosquitos infectados y tipo salvaje. Los métodos minimizan la adaptación de laboratorio y aplicación exogamia para aumentar la relevancia de los experimentos a los mosquitos de campo. Además, las colonias se mantienen en condiciones óptimas para maximizar su aptitud para los lanzamientos de campo abierto.

Figura 4 muestra los efectos de la nutrición subóptima en el desarrollo de larvas de Ae. aegypti . Cuando contenedores cuentan con 0,25 mg de alimento por larva por día o menos, aumenta el tiempo de desarrollo para hombres y mujeres, y menos sincrónico que en contenedores cuenta con 0.5 mg de alimento. Si no se proporciona alimentación adecuada durante toda la duración del desarrollo larvario, esto podría tener un impacto adverso en el program...

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Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

14.1K vistas.  Bio21 Institute and University of Melbourne. Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

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Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Investigación

Medio ambiente

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Wolbachia Infección bacteriana en Drosophila

Biología

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

El mantenimiento de Wolbachia en medio libre de células

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control strategies. CRISPR-based homing gene drive systems have made transgenic technologies more accessible within the scientific community. Evaluation of transgenic mosquito performance and comparisons with wild-type counterparts in small laboratory cage trials provide valuable data for the design of subsequent field cage experiments and experimental assessments to refine the strategies for disease prevention. Here, we present three different protocols used in laboratory settings to evaluate transgene spread in anopheline mosquito vectors of malaria. These include inundative releases (no gene-drive system), and gene-drive overlapping and non-overlapping generation trials. The three trials vary in a number of parameters and can be adapted to desired experimental settings. Moreover, insectary studies in small cages are part of the progressive transition of engineered insects from the laboratory to open field releases. Therefore, the protocols described here represent invaluable tools to provide empirical values that will ultimately aid field implementation of new technologies for malaria elimination.

The protocols reported here illustrate three alternative ways to assess the performance of genetically-engineered mosquitoes destined for vector control in laboratory-contained small cage trials. Each protocol is tailored to the specific modification the mosquito strain bears (gene drive or non-gene drive) and the types of parameters measured.

Ensayos de laboratorio en jaulas pequeñas de mosquitos anofelinos genéticamente modificados

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Genética

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Inmunología e Infección

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

Preparación de mosquitos Aedes aegypti machos irradiados y marcados para su liberación en un programa operativo de técnica de insectos estériles

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...