Este protocolo ayuda a verificar la existencia de Wolbachia en las células, que es la base para comprender la interacción entre Wolbachia y su huésped. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia, lo que corroboró y mejoró la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células. La demostración del procedimiento será Qiuqiu Xiao, un postgrado del Laboratorio Clave de Biología y Características de Patógenos Modernos.
Comience observando células Aa23 y Aa23-T no teñidas a un aumento de 100x utilizando microscopía de luz. Cultive las células durante cinco a siete días para alcanzar una confluencia del 70 al 80% por matraz. Usando una pipeta, transfiera 1 ml del medio de cultivo a un tubo de microcentrífuga.
Centrifugar a 100 RCF durante cinco minutos para cosechar las células. Retire el sobrenadante y almacene el pellet celular resultante a menos 20 grados centígrados. Cultive las células durante cinco a siete días para alcanzar una confluencia del 90 al 100% por matraz.
Resuspender los pellets en 0,40 ml de PBS y transferir 50 microlitros de esta solución a un tubo de microcentrífuga. Agregue cinco microlitros de 20 mg / ml de proteinasa K e incube a 55 grados Celsius durante una hora. Luego incuba los tubos a 99 grados Celsius durante 15 minutos para obtener el ADN crudo y almacenarlo a menos 20 grados Celsius.
Para realizar la PCR, prepare una mezcla de reacción total de 20 microlitros y establezca las condiciones de PCR como se describe en el manuscrito de texto. Detecte el ADN en un gel de agarosa al 1% utilizando un generador de imágenes de gel. Realice la amplificación cuantitativa por PCR utilizando TB Green en un sistema de PCR en tiempo real y registre los resultados de cada reacción.
Analizar el ADN en un volumen total de reacción de 20 microlitros y establecer las condiciones cuantitativas de PCR como se describe en el manuscrito de texto. Calcule los números de copia de los genes WSP y RPS6 en las células de acuerdo con la curva estándar establecida. A continuación, calcule la densidad relativa de Wolbachia por el número de copia de wsp/RPS6.
Analice los datos utilizando una prueba t de muestras independiente. Agregue 200 microlitros de tampón de lisis a la bolita celular e incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugar los lisados a 12.000 RCF durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante.
Analice la concentración wsp del sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína BCA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Cargue cantidades iguales de proteína en un gel 15% SDS-PAGE. Transfiera la proteína a las membranas de nitrocelulosa y bloquee las membranas con leche desnatada al 5% durante dos horas a temperatura ambiente.
Luego lave las membranas tres veces con TBST. Incubar las membranas durante la noche a 4 grados centígrados con 100 microlitros de anticuerpo policlonal anti-wsp preparado diluyendo el anticuerpo primario con leche desnatada al 5%. Lave el anticuerpo primario tres veces con TBST.
Agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante a las membranas e incube en un agitador durante una hora a temperatura ambiente. Lave las membranas tres veces con TBST y mezcle 20 microlitros de solución A y 20 microlitros de solución B en el kit de detección de quimioluminiscencia en una proporción de uno a uno. Sumerja toda la membrana en la solución de luminiscencia simultáneamente y observe las señales utilizando un sistema de imágenes multifuncional.
En una placa de Petri confocal láser, incube las células Aa23 y Aa23-T durante tres o cuatro días a 28 grados Celsius bajo un 5% de dióxido de carbono atmosférico. Cuando la célula alcance el 60 a 70% de confluencia, lave las células tres veces con PBS. Fije las células en un ml de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.
Lave las células fijas con PBST durante cinco minutos y vuelva a lavar las células dos veces con PBS. Incubar la placa de Petri en un ml de albúmina sérica bovina al 3% durante una hora a 37 grados centígrados. Agregue 100 microlitros de anticuerpo policlonal anti-wsp de ratón y suero de ratón a los portaobjetos e incube durante la noche en una caja húmeda a cuatro grados centígrados.
Retire la placa de Petri de la caja húmeda y devuélvala a temperatura ambiente. Lávelos tres veces con PBS y retire el PBS. Proteja los siguientes procedimientos de la luz.
Incubar la placa de Petri con 100 microlitros de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado alexa Fluor 488 a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Incubar la placa de Petri de muestra con 50 microlitros de DAPI diluidos en PBS a 10 microgramos/ml a 37 grados Celsius durante cinco minutos y luego lavarlos tres veces con PBS. Observe la inmunotinción bajo un microscopio confocal.
Antes de detectar Wolbachia, se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar las diferencias morfológicas entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y AA23-T tenían al menos dos morfologías celulares, pero no se observaron diferencias morfológicas aparentes entre los dos tipos de células. Utilizando los cebadores de diagnóstico 81F/691R, se detectó amplificación positiva del gen Wolbachia wsp en células Aa23 pero no en células Aa23-T.
El análisis de la densidad de Wolbachia en las líneas celulares mostró una relación wsp/rps6 de 2,4 en las células Aa23, pero no Wolbachia en las células Aa23-T. El análisis de Western blot de extractos de proteínas mostró una fuerte señal wsp para Aa23, pero no se detectó ninguna señal para Aa23-T. El ensayo de inmunofluorescencia indirecta detectó la proteína wsp en las células Aa23, mientras que solo se detectó ADN teñido con DAPI en las células Aa23-T.
Asegúrese de que los matraces de cultivo se incuban a 28 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono atmosférico durante cinco a siete días. Este procedimiento puede ser seguido por microscopía electrónica donde uno necesita prestar especial atención a la preparación y seccionamiento de la muestra. Los cuatro métodos experimentales utilizados en este estudio confirmaron la precisión de detección de la infección por Wolbachia en las células, que también es aplicable a otros tipos de células y tejidos.
