Name: maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia
Uploaded: 2017-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia at JoVE.com

Riconosciamo Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson e Clare Doig per il loro contributo allo sviluppo dei nostri metodi di manutenzione di Colonia e tre utenti anonimi per i suggerimenti che ci ha aiutato a migliorare il manoscritto. La nostra ricerca è supportata da un programma grant e la fellowship di AAH dal National Health e il Medical Research Council e una traduzione concedere dal Wellcome Trust. PAR è un destinatario di un australiano governo ricerca formazione programma di borsa di studio.

Alimentazione di sangue di zanzare su soggetti umani è stato approvato dall'Università di Melbourne Comitato etica umana (approvazione n.: 0723847). Tutti i volontari forniti informato consenso scritto.
1. larvale allevamento
Nota: Le zanzare sono tenute presso 26 ± 0,5 ° C e 50-70% di umidità relativa, con un fotoperiodo di 12:12 h (luce: scuro) per questo protocollo di manutenzione di Colonia. Queste condizioni sono simili alle condizioni climatiche media a Cairns, Australia e all'interno della gamma termica ottima per Ae. aegypti sopravvivenza e sviluppo44,45,46. Temperature elevate possono causare la perdita di Wolbachia infezioni da colonie di zanzare e dovrebbero essere evitato47. Manteniamo almeno 500 persone per popolazione per minimizzare la consanguineità; mantenimento di colonie di dimensioni inferiori può avere conseguenze di fitness [Ross et al. inedito]. Sotto queste condizioni e supponendo che una nutrizione adeguata, il tempo di generazione medio è di 28 giorni (Vedi tabella 1).
<ol><li>Immergere le uova sul substrato in vassoi (Figura 1A) contenente 3 L di acqua (acqua di osmosi inversa o acqua di rubinetto invecchiata, generato lasciando l'acqua del rubinetto in vassoi per 24 h prima dell'uso), ~ 300 mg di cibo per pesci (uno schiacciato tablet, Vedi Materiali tavolo) e un alcuni grani di lievito secco attivo per indurre la schiusa48.</li>
	<li>Un giorno dopo la schiusa, usare una pipetta di vetro per trasferire circa 500 larve ai vassoi contenenti 4 L di acqua (Figura 1B), conteggio utilizzando un contatore di clicker. Aggiungere due compresse di cibo di pesce schiacciato ogni vassoio. Se necessario, utilizzare contenitori di diverse dimensioni per l'allevamento di larve (Figura 1A), ma tieni larvale densità inferiori a 0,5 larve/mL per evitare sovraffollamento.</li>
	<li>Verifica i vassoi di ogni giorno per assicurare che le larve hanno cibo a sufficienza; aggiungere circa due compresse di cibo ai vassoi ogni due giorni. Fornire cibo ad libitum , ma garantire che 0,5 mg/larva/giorno è disponibile durante questo periodo per garantire sviluppo è sincrono e dimensione corporea è coerente, altrimenti possono essere confusi i risultati degli esperimenti (Vedi risultati rappresentante).</li>
	<li>Fare attenzione a evitare la sovralimentazione delle larve, particolarmente in contenitori più piccoli allevamento con acqua meno volume e superficie. Se l'acqua sembra nuvoloso o se non esiste una significativa mortalità larvale, sostituirlo con acqua fresca; mortalità deve essere trascurabile se le larve sono alimentate in modo ottimale.</li>
</ol>2. adulti emersione
Nota: Le larve cominceranno a pupate da cinque giorni dopo la schiusa, se ben nutriti e la maggior parte dovrebbe pupate di sette giorni dopo la schiusa. Gli adulti inizierà emergenti circa due giorni dopo l'impupamento, se mantenuta in modo ottimale a 26 ° C (Vedi Risultati rappresentante). Lo sviluppo larvale è tipicamente influenzato da Wolbachia infezioni quando un ampio è previsto il23,39,49.
<ol><li>Sette giorni dopo la schiusa versare l'intero contenuto del vassoio attraverso una maglia fine (poro formato 0,4 mm). Mantenere l'acqua filtrata larvale per un uso successivo in ovicups (Vedi sezione "Sangue alimentazione e deposizione delle uova"). Invertire la mesh e immergerlo in un recipiente di plastica con 200 mL di acqua per trasferire le pupe. Fornire cibo supplementare se qualsiasi larve rimangono.</li>
	<li>Preparare le gabbie di emersione adulto (Figura 1) fornendo due tazze di soluzione di saccarosio al 10% (Figura 1F) e due Coppe di ovatta umida per evitare il disseccamento (Figura 1E).</li>
	<li>Se non è necessario che le pupe essere filtrate per sesso, mettere i contenitori con coperchio di pupe nella gabbia e lasciare il coperchio leggermente aperta per permettere gli adulti ad emergere nella gabbia. In alternativa, posizionare un imbuto rovesciato sopra il contenitore per ridurre al minimo l'annegamento. Assicurarsi che tutti gli adulti sono emerse prima di rimuovere il contenitore dalla gabbia per impedire la selezione contro gli sviluppatori lenti.</li>
</ol>3. pupal sessaggio per esogamici
<ol><li>Se le pupe devono essere ordinati dal sesso (ad es., per esogamici), pipettare le pupe da vassoi larvale e separare i due sessi (Figura 2) in contenitori di plastica (Figura 1A) con 200 mL di acqua ogni 24 ore fino al numero desiderato di ciascun sesso è stato raggiunto. Mettere i coperchi sui contenitori e lasciarli chiusi.</li>
	<li>Gli adulti emergerà nei contenitori; confermare loro sesso prima di rilasciare in gabbie (Figura 2). Rimuovere eventuali adulti sessuati in modo non corretto con un aspiratore entro 24 h dalla emersione prima che raggiungano la maturità sessuale. Una volta che i sessi sono stati confermati, rilasciare gli adulti in gabbie ogni 24 ore.</li>
	<li>
Per ottenere Wolbachia-colonie infettate di un simile background genetico di una popolazione naturale, outcross aggiungendo Wolbachia-infettati femmine da colonie di laboratorio nelle gabbie dei maschi non infetti derivati da uova raccolte da ovitrap in il campo39, mantenendo la densità prescritta di 500 persone per popolazione.
	<ol>
<li>Ripetere l'esogamici per almeno tre generazioni successive per la produzione di colonie che sono almeno 87,5% simili geneticamente per la popolazione di campo39. Critico: Assicurarsi che i sessi siano corretti in questa fase (Vedi punto 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Femmina Ae. aegypti sono solitamente refrattari all'ulteriore inseminazione entro ore di accoppiamento50. Quando esogamici colonie, consentire le femmine e i maschi a maturare in gabbie separate per due giorni e quindi aspirare le femmine nella gabbia maschio di fornire pari opportunità a tutti i maschi.</li>
</ol>4. sangue alimentazione e deposizione delle uova
<ol><li>
Attendere almeno tre giorni dopo l'ultima femmina è emerso prima sangue alimentazione per consentire un ampio tempo per maturare. Sangue di nutrire le femmine entro due settimane dalla nascita per prevenire la mortalità eccessiva, in particolare per le zanzare con le infezioni di Wolbachia che influenzare negativamente la longevità22,24,49. Togliere le tazze di zucchero il giorno prima della poppata per migliorare i tassi di alimentazione.
	<ol>
<li>Chiedere ad un volontario per inserire loro avambraccio nella gabbia per consentire le zanzare femmina da sfamare. La maggior parte delle femmine dovrebbero nutrire di replezione entro 5 min, ma per ridurre la selezione contro lenti mangiatoie, lasciare l'avambraccio nella gabbia per 15 minuti, o fino a quando tutte le femmine sono visibilmente gonfie; un guanto di lattice per proteggere la mano da morsi è facoltativo ma consigliato.</li>
		<li>Due giorni dopo il pasto di sangue, posizionare due tazze di plastica contenente acqua di allevamento larvale e foderato con una striscia di carta vetrata (Figura 1) (o carta da filtro (Figura 1 H)) nella gabbia per le femmine per deporre le uova. Parzialmente e immergere la striscia di carta vetrata in acqua per mantenerla umida. Rimuovere altre fonti di acqua per impedire che le femmine depongono le uova fuori la Coppa di deposizione delle uova. Nota: l'acqua del rubinetto può essere utilizzato nelle coppe, ma acqua di allevamento larvale incoraggia la deposizione delle uova51,52 e femmine deporranno le uova più in modo sincrono.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. uovo raccolta e condizionamento
<ol><li>Le femmine deporranno le uova sulla carta vetrata appena sopra la linea di galleggiamento; raccogliere e sostituire le strisce di carta vetrata al giorno fino a quando non più uova. Nota che tale deposizione delle uova può continuare fino a una settimana.</li>
	<li>Strisce di carta vetrata parzialmente asciugare tamponando delicatamente su un tovagliolo di carta per 30 s, facendo attenzione a non per staccare le uova. Avvolgere le strisce in un foglio di scottex asciutto, quindi metterlo in un sacchetto di plastica sigillabile (Figura 1I).</li>
	<li>Verificare lo stato delle uova sotto un microscopio per dissezione (Figura 3). Se la carta vetrata le strisce sono troppo bagnati, uova possono nascere prima di essere immerso in acqua (Figura 3B), ma se secchi troppo duramente, uova possono sprofondare (Figura 3).</li>
	<li>Le uova possono essere covate in qualsiasi momento di là di post-raccolta tre giorni; si schiudono tutte le uova da ogni Colonia, raccolte attraverso tutti i giorni, nello stesso contenitore di acqua per assicurare che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale degli individui.</li>
	<li>Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere le uova in un contenitore sigillato con un'umidità elevata (> 80%) a circa 20 ° C. In queste condizioni, le uova senza Wolbachia possono essere conservate per diversi mesi mantenendo alta tratteggio tariffe53,54.</li>
	<li>Come alcune infezioni di Wolbachia riducono notevolmente la redditività delle uova con età49,55, si schiudono le uova da Wolbachia-infettato linee entro una settimana dalla raccolta per evitare la mortalità eccessiva per il pertinente ceppi. Sangue nutrire le femmine nuovamente dopo una settimana se sono necessari più uova.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Giorno</td>
			<td colspan="3">Passo</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Uova di tratteggio</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Larve di conteggio nei vassoi</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Trasferire le larve e pupe di gabbie di Colonia</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Sangue di alimentazione femminili adulti</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Iniziare a raccogliere le uova</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Terminare la raccolta delle uova</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Uova di tratteggio</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Panoramica del programma di controllo Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. I tempi di sangue-alimentazione femmina e la schiusa delle uova è flessibili, ma lunghe durate in queste fasi dovrebbero essere evitate, in particolare per le zanzare infettate con Wolbachia, al fine di ridurre al minimo la mortalità. Seguendo questo programma riduce al minimo la selezione contro le zanzare che sono veloce o lento per sviluppare o maturo in tutte le fasi di vita, a condizione che le larve sono alimentate in modo ottimale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Figura 1: Attrezzature utilizzate per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio. Contenitori di plastica (A) utilizzati per uova da cova o di allevamento di larve con volumi di 500, 750 e 5.000 mL (da sinistra a destra). (B) vassoi utilizzati per l'allevamento di larve ad una densità controllata, solitamente 500 larve in 4 L di acqua. (C) (D), 3L gabbie utilizzate per adulti di alloggiamento e 19,7 L. Una densità di 25 adulti o meno al litro dovrebbe essere mantenuto per fornire spazio sufficiente. Coppa di 35 mL (E) con ovatta umida fornita come una fonte di acqua per gli adulti. (F) tazza da 35 mL con soluzione di saccarosio fornita attraverso un cavo o stoppino dentale come una fonte di zucchero. (G–H) Tazze riempite con acqua di allevamento larvale e fiancheggiata da un substrato di deposizione delle uova di carta vetrata o carta da filtro (G e H, rispettivamente). (io) chiusura lampo sacchetto usato per la conservazione di strisce di carta vetrata o carta da filtro. Macchie nere sulla carta vetrata sono uova di zanzara. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Figura 2: Laterale (A) e dorsale (B) viste di pupe e adulti Ae. aegypti (C) dimostrando il dimorfismo sessuale. I maschi sono posizionati a sinistra e le femmine a destra in ogni pannello. Quando alimentato in modo ottimale, pupe maschi e femminile si distinguono per dimensioni; le femmine sono più grandi dei maschi (A) ed hanno un cefalotorace relativamente bulboso rispetto ai maschi che hanno i lati più piatto (B). Maschi adulti sono facilmente distinguibili dalle femmine in tutte le condizioni di allevamento, principalmente di loro antenne piumosa e palpi lunghi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Nella figura 3. Quattro giorno vecchio Ae. aegypti uova in condizioni diverse. (A) intatto uova su strisce di carta vetrata mantenuti ad un'umidità elevata (> 80%) ma senza alcun'umidità visibile. Tassi del portello devono essere superiore al 90% per il selvaggio-tipo Ae. aegypti se mantenuta correttamente. (B) le uova che si schiudono prima di essere immerso in acqua (schiusa precoce) si distinguono per un cappuccio staccato uovo e larva visibile. Questo indica che la striscia di carta vetrata è stata mantenuta troppo umida. (C) le uova che sono asciugate troppo duramente potrebbero collassare e sono chiaramente visibili dalla loro apparenza concava. Se la carta vetrata si irrigidisce ciò indica anche che le uova possono essere troppo asciutte. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Seguendo il protocollo presentato qui per la manutenzione di Wolbachia-infetti Ae. aegypti dovrebbero assicurare che le zanzare sane di una qualità costante sono prodotte per esperimenti e aprire campo releases. A differenza di altri protocolli che privilegiano la produzione di massa quantità di zanzare (Vedi riferimento57), i metodi si concentrano su come massimizzare la loro idoneità, sia all'interno di generazioni implementando rilassate condizioni di allevamento e da altra...

Le zanzare Aedes aegypti sono responsabili della trasmissione di alcune dell'arbovirus più importanti del mondo, tra cui la dengue, Zika e chikungunya1. Questi virus stanno diventando una crescente minaccia per la salute globale, come la distribuzione capillare di Ae. aegypti nei tropici continua ad espandersi2,3,4. Femmina Ae. aegypti preferenzialmente si nutrono di sangue umano5 e quindi tendono a vivere in prossimità di esseri umani, soprattutto nelle aree urbane, dove le popolazioni sono più densi. Attraverso questa stretta associazione con gli esseri umani si sono adattati anche per allevare in habitat artificiali, compresi i pneumatici, vasi, grondaie e serbatoi acqua6,7. AE. aegypti anche facilmente adattarsi ad ambienti di laboratorio dove può essere mantenute senza requisiti speciali dopo essere raccolte direttamente dal campo, a differenza di alcune altre specie nel genere Aedes 8, 9,10. La facilità di manutenzione ha visto loro ampiamente studiato in laboratorio in una vasta gamma di campi, in ultima analisi, con l'obiettivo di controllare le malattie zanzare può trasmettere.
Tradizionalmente, controllo arbovirus dipende fortemente l'uso di insetticidi per ridurre le popolazioni di zanzare. Tuttavia, vi è crescente interesse approcci dove le zanzare modificate sono allevate in laboratorio e poi rimesso in popolazioni naturali. Rilasciate le zanzare possono essere modificate geneticamente11,12,13, biologicamente14,15, attraverso irradiazione16, trattamento chimico17,18, o con combinato tecniche19 per sopprimere le popolazioni di zanzare o sostituirli con le zanzare che sono refrattari a arbovirus trasmissione20.
Wolbachia sono batteri che vengono attualmente utilizzati come agente di controllo biologico per gli arbovirus. Diversi ceppi di Wolbachia recentemente sono stati introdotti in Ae. aegypti sperimentalmente mediante microiniezione embrionali21,22,23,24. Questi ceppi riducono la capacità dell'arbovirus di diffondere e replicare nella zanzara, diminuendo la loro trasmissione potenziale23,25,26,27,28 . Wolbachia infezioni vengono trasmessi dalla madre alla prole, tuttavia alcuni ceppi inducono sterilità quando infetti maschi si accoppiano con le femmine non infetti22. Wolbachia-maschi infetti pertanto possono essere rilasciati in grandi quantità per sopprimere popolazioni di zanzara naturale, come recentemente dimostrati in altri15,specie di Aedes 29. Tuttavia, poiché Wolbachia inoltre inibiscono la trasmissione arbovirus in Ae. aegypti, zanzare possono essere rilasciate anche per sostituire le popolazioni native con vettori più poveri. Ae. aegypti infettati sperimentalmente con Wolbachia ora vengono rilasciate nel campo in diversi paesi che utilizzano questo approccio posteriore14,30,31.
Wolbachia-approcci di basati per controllo arbovirus si basano su una solida comprensione delle interazioni tra Wolbachia, la zanzara e l'ambiente. Wolbachia si presentano naturalmente in una vasta gamma di insetti, e le deformazioni introdotte le zanzare sono diverse nei loro effetti32. Come vengono introdotti nuovi tipi di infezione di Wolbachia in Ae. aegypti24, è necessario caratterizzare ogni ceppo per i loro effetti sulla zanzara fitness, riproduzione e arbovirus interferenza in una gamma di condizioni. Rigorosa sperimentazione in laboratorio è pertanto necessaria per valutare il potenziale per i ceppi di Wolbachia avere successo nel campo.
Uscite di campo aperto di Ae. aegypti con Wolbachia infezioni possono spesso richiedono migliaia o decine di migliaia di zanzare per zona di rilascio per essere allevato ogni settimana14,30,31. Il successo delle versioni iniziali può essere migliorato attraverso il rilascio di zanzare di grandi dimensioni per massimizzare la loro fecondità33 e accoppiamento successo34,35. Le zanzare dovrebbero anche essere adattate alle condizioni che essi sperimenteranno nel campo, tuttavia a lungo termine laboratorio allevamento può causare cambiamenti nel comportamento e fisiologia che poteva avere un impatto campo prestazioni36,37, 38.
Descriviamo un semplice protocollo per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio con attrezzature di base. Questo protocollo è adatto per entrambi selvaggio-tipo e Wolbachia-infettato le zanzare, il posteriore di quale può richiedere particolare attenzione come alcuni ceppi di Wolbachia hanno effetti sostanziali sulla zanzara vita-storia tratti39, 40. le condizioni di allevamento evitare sovraffollamento e competizione per il cibo per produrre le zanzare di una dimensione coerente, che è critica per competenza vettoriale ed esperimenti di fitness e garantisce che le zanzare sono sane per il rilascio di campo41 . Inoltre prendiamo precauzioni per minimizzare laboratorio adattamento e consanguineità riducendo le pressioni selettive e garantire che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale. Tuttavia, ambienti di laboratorio sono distintamente differenti da condizioni di campo e manutenzione a lungo termine in condizioni rilassate potrebbe ridurre l'idoneità delle zanzare al momento del rilascio in campo37,42,43 . Attraversiamo quindi le femmine da linee di laboratorio ai maschi di campo-raccolti periodicamente, conseguente colonie che sono geneticamente simili per confronti sperimentali e che sono adattati per la destinazione campo popolazione39. I metodi non richiede attrezzature specializzate e possono essere scalati a posteriore decine di migliaia di individui a settimana per i rilasci di campo. Il protocollo inoltre assegna una priorità l'idoneità delle zanzare all'interno e attraverso le generazioni, una considerazione importante per insetti destinati per l'istituzione nelle popolazioni naturali. Il protocollo è adatto per la maggior parte dei laboratori che richiedono manutenzione di Ae. aegypti, particolarmente per i confronti sperimentali dove una qualità costante di zanzare e relatability al campo sono importanti.

<table><tbody><tr><td>Wild type &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; Mel-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Walker and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;23&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; AlbB-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Xi and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;21&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; MelPop-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;22&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>Instant dried yeast</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used</td></tr><tr><td>5 L plastic tub</td><td>Quadrant</td><td>Q110950</td><td>Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used</td></tr><tr><td>Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td></td><td></td><td>Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td></td><td></td><td>Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Clicker counter</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Rearing trays</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td></td><td></td><td>Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Cages</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup lid</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Cotton wool</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used</td></tr><tr><td>White Sugar</td><td></td><td></td><td>Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores</td></tr><tr><td>Rope</td><td>M Recht Accessories</td><td>C323C/W</td><td>Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr><tr><td>Plastic cup (large)</td><td></td><td></td><td>Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable</td></tr><tr><td>Sandpaper</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia

Le zanzare Aedes aegypti infettate sperimentalmente con Wolbachia stanno utilizzandi in programmi per controllare la diffusione di arbovirus come dengue, chikungunya e Zika. Wolbachia-zanzare infette possono essere rilasciate nel campo di ridurre dimensioni di popolazione attraverso accoppiamenti incompatibili o trasformare popolazioni con le zanzare che sono refrattari alla trasmissione del virus. Per queste strategie avere successo, le zanzare rilasciate nel campo dal laboratorio devono essere competitive con le zanzare autoctone. Tuttavia, mantenere le zanzare in laboratorio può provocare inbreeding, deriva genetica e adattamento di laboratorio che può ridurre la loro idoneità nel campo e può confondere i risultati degli esperimenti. Per verificare l'idoneità dei diversi Wolbachia infezioni per la distribuzione in campo, è necessario mantenere le zanzare in un ambiente di laboratorio controllato attraverso più generazioni. Descriviamo un protocollo semplice per mantenere le zanzare Ae. aegypti in laboratorio, che è adatto per entrambi Wolbachia-zanzare infette e wild-type. I metodi minimizzare adattamento di laboratorio e implementano esogamici per aumentare la rilevanza degli esperimenti alle zanzare di campo. Inoltre, colonie sono mantenute in condizioni ottimali per massimizzare la loro idoneità per i rilasci di campo aperto.

Figura 4 illustra gli effetti della nutrizione suboptimale sullo sviluppo delle larve di Ae. aegypti . Quando sono disponibili contenitori con 0,25 mg di cibo al larva al giorno o meno, aumenta il tempo di sviluppo per sia i maschi che le femmine, ed è meno sincrona rispetto in contenitori fornita con 0,5 mg di cibo. Se un'alimentazione adeguata non viene fornita per tutta la durata dello sviluppo larvale, questo potrebbe avere un impatto negativo s...

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia at JoVE.com

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Le zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia vengono rilasciate in popolazioni naturali di sopprimere la trasmissione dell'arbovirus. Descriviamo i metodi retro Ae. aegypti con Wolbachia infezioni in laboratorio per esperimenti e rilascio di campo, prendendo precauzioni per ridurre al minimo la selezione e l'adattamento di laboratorio.

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

maintaining-aedes-aegypti-mosquitoes-infected-with-wolbachia

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

14.1K Views.  Bio21 Institute and University of Melbourne. Le zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia vengono rilasciate in popolazioni naturali di sopprimere la trasmissione dell'arbovirus. Descriviamo i metodi retro Ae. aegypti con Wolbachia infezioni in laboratorio per esperimenti e rilascio di campo, prendendo precauzioni per ridurre al minimo la selezione e l'adattamento di laboratorio.

Video: Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

Produzione di massa di Aedes aegypti geneticamente modificati per rilasci sul campo in Brasile

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Ricerca

Ambiente

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Wolbachia infezione batterica in Drosophila

Biologia

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Il mantenimento di Wolbachia in Cell-free medio

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control strategies. CRISPR-based homing gene drive systems have made transgenic technologies more accessible within the scientific community. Evaluation of transgenic mosquito performance and comparisons with wild-type counterparts in small laboratory cage trials provide valuable data for the design of subsequent field cage experiments and experimental assessments to refine the strategies for disease prevention. Here, we present three different protocols used in laboratory settings to evaluate transgene spread in anopheline mosquito vectors of malaria. These include inundative releases (no gene-drive system), and gene-drive overlapping and non-overlapping generation trials. The three trials vary in a number of parameters and can be adapted to desired experimental settings. Moreover, insectary studies in small cages are part of the progressive transition of engineered insects from the laboratory to open field releases. Therefore, the protocols described here represent invaluable tools to provide empirical values that will ultimately aid field implementation of new technologies for malaria elimination.

The protocols reported here illustrate three alternative ways to assess the performance of genetically-engineered mosquitoes destined for vector control in laboratory-contained small cage trials. Each protocol is tailored to the specific modification the mosquito strain bears (gene drive or non-gene drive) and the types of parameters measured.

Prove di laboratorio su piccole gabbie di zanzare anofelino geneticamente modificate

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Genetica

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Immunologia e infezioni

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

Preparazione di zanzare Aedes aegypti maschi irradiate e marcate per il rilascio in un programma operativo di tecnica degli insetti sterili

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...