Este trabajo fue financiado por el programa de Bernard L. Schwartz para los científicos de médico en la Universidad de Rockefeller, el fondo de desarrollo terapéutico de Robertson de la Universidad de Rockefeller y el centro de Sackler para Biomedicina e investigación de la nutrición en la Universidad de Rockefeller.

todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Rockefeller &#39; s cuidado de Animal institucional y Comité de uso. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas.
 1. quimiotaxis In Vitro <ol><li>cultura THP-1 células 6 en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 4-(2-hidroxietil) -1- ácido-1-ácido (HEPES; 25 mM) (completar los medios), mantener la densidad entre 0.5-1.0 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Cultivo de células en un 35 mm plato, etiqueta 3.5 x 10 5 THP-1 de células por condición con calceína acetoxymethyl (calceína-AM; 2.5 μm) u otro colorante fluorescente adecuado en medios completo a 37 ° C durante 30 minutos 
	Nota: Tintes deben ser compatible con el etiquetado de células vivas y permeable a la membrana celular.</li>
	<li>Pre-caliente un lector de placas a 37 ° C. 
	Nota: Además del control de temperatura, funcionalidad de lectura de la parte inferior también es necesario. Ver paso 1.10.2 para una alternativa a un lector de placas para la cuantificación de la migración de las células.</li>
	<li>Mientras que las células son etiquetas, preparar la placa de ensayo y la cámara baja.
	Placa de <ol><li>uso un cultivo de tejido de 24 pozos, con una condición por pozo. Realizar cada condición por triplicado.</li>
		<li>Añadir 750 μl de Hank &#39; s solución salina tamponada (HBSS) tamponado con 25 mM HEPES y 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) para la placa de 24 pocillos. Esto sirve como la condición basal de control.
		<ol><li>Uso otros pozos para las condiciones de comparación, manteniendo siempre el volumen total en la cámara inferior en 750 μl. 
			Nota: En este ejemplo, humano monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) sirve como control positivo para quimiotaxis 7.
			<ol><li>Montar la mezcla de reactivo HBSS con 25 mM HEPES, BSA (0.1%) y MCP-1 (75 ng/mL). Utilizar suero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 como un control positivo adicional. 
				Nota: Concentración de Chemokine y chemokine dependerá el eje quimiotáctico bajo estudio. Liofilizado de MCP-1 se resuspendió en agua destilada con BSA (0,1%) para hacer una solución con una concentración final de 50 μg/mL. Esto se puede diluir en agua a una solución de trabajo de 10 μg/mL. Añadir 5.6 μL de esta solución a la cámara baja.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Una vez finalizada la composición de las cámaras inferiores, coloque una pieza porosa en cada pocillo, asegurando que alineen las lengüetas del inserto con las muescas de la placa. 
		Nota: Elija el tamaño de poro adecuado para los insertos. Para monocitos y linfocitos, realiza bien un tamaño de poro de 3 μm. Algunos tipos de células o sistemas de chemokine pueden requerir una superficie revestida de matriz para la migración óptima. Por ejemplo, para la medición de la Quimiotaxis de monocitos THP-1 hacia la MCP-1, fibronectina o insertos recubiertos de colágeno se recomiendan. Para el lector de placas para la cuantificación, el inserto debe tener una capa luz impermeant, tales como tereftalato de polietileno, para evitar la detección de no-migrar las células en la parte superior del compartimiento 8.</li>
	</ol></li> <li>Después de incubar las células por 30 min con calceína-AM, transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 minutos inspección visualmente las células para confirmar la absorción de calceína-AM ( figura 1).</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío. Lavar las células etiquetadas en 1640 RPMI sin suero suplementado con HEPES 25 mM. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descarte el sobrenadante.</li>
	Resuspender las células en suero RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM <li>. Contar las células y ajustar el volumen para que las células están en una concentración final de 1.0-1.5 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Suministrar 250 μL de la suspensión de células en el inserto (cámara alta).</li>
	<li>Después de las cámaras superiores se han llenado, suavemente Levante la placa e inspección la parte inferior la presencia de burbujas de aire que pueden interferir con la detección y la migración. Para quitar una burbuja, primero prueba a quitar entonces reposicionar el inserto. Si no lo consigue, use una aguja de 27 G a pinchar la burbuja y luego vuelva a colocar el inserto.</li>
	<li>Coloque la placa en el lector de la placa con 37 ° C.
	<ol><li>Adquirir lecturas de fluorescencia desde el fondo a intervalos de 1-3 min. Cuando se utiliza calceína-AM, establece la fluorescencia longitudes de onda de excitación y emisión a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Dependiendo del sistema de la tipo y quimioquinas de la célula, chemotaxis ocurre típicamente durante 1-4 h ( figura 2A).</li>
		<li>Como una alternativa a las mediciones continuas utilizando un lector de placas, imagen los pozos utilizando un microscopio fluorescente invertido ( figura 2B) capaz de excitación y detección de la luz a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Usar una ampliación baja para capturar a la mayoría de la parte inferior de la inserción. Cuantificar las células mediante el procesamiento de imágenes ImageJ o software similar 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. La transferencia adoptiva de linfocitos murinos <ol><li>preparación de células de donante <ol><li>Anesthetize semana 8-12-viejos ratones C57BL/6J donante masculino usando un vaporizador de la anestesia isoflurano (1-3%). Confirmar la adecuada profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca.</li>
		<li>Colocar el ratón en la posición supina. Haga una incisión de línea media con un bisturí y localizar el bazo en el espacio peritoneal izquierdo superior. Suprimir el bazo entero y coloque en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS y 25 mM HEPES; 1 bazo mL) en hielo. Eutanasia a animales anestesiados donantes por degollación.</li>
		<li>Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en medios completo (/spleen de 1 mL) con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a un tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>Añadir 4 volúmenes de cloruro de amonio lisis de potasio (ACK) de búfer e incubar 5 min a temperatura ambiente para lisar eritrocitos.</li>
		<li>Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Si los eritrocitos permanecen en el sedimento, resuspender en tampón de lisis ACK, incubar 5 min a temperatura ambiente, centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en medios de comunicación completa en una concentración de 2-5 x 10 7 células/mL, luego cuele la suspensión de células a través de una malla de nylon de 40 μm para eliminar restos de células.</li>
		<li>Etiqueta de 1 x 10 7 ratón de células/receptor con un colorante fluorescente compatible con vive las células y que se mantendrá con fijación posterior, como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentración final 2 μM) 10 . Incubar a 37 ° C por 30 minutos 
		Nota: Para el seguimiento de más de una población celular, utilizar otros tintes fluorescentes con poblaciones celulares adicionales. Visualizador, una porción de células del donante puede ser etiquetada con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoilo) amino) tetramethylrhodamine (concentración final 2 μM) 11.</li>
		<li>4 añadir volúmenes HBSS complementado con 25 mM HEPES, luego centrifugar a 1.000 x g durante 2 minutos y descartar sobrenadante. Resuspender el precipitado en HBSS suplementado con HEPES 25 mM para una concentración final de 1 x 10 8 células/mL.
		<ol><li>Si utiliza más de un colorante fluorescente, mantener poblaciones celulares separadas hasta inmediatamente antes de la inyección.</li>
			<li>Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células de cada color en una solución fijadora (1 mL) para compensación de citometría de flujo posterior.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Transferencia de linfocitos <ol><li>anestesiar 8-12 semanas-ratones viejo receptoras de machos C57BL/6J con isoflurano (1-3%) usando un vaporizador; confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. Aplique ungüento veterinario animal &#39; ojos s para prevenir la resequedad.</li>
		<li>Brevemente las células donantes de vortex (1 s) y la transferencia a la jeringa de inyección de 1 mL 27 g, 0,5 en aguja, combinando poblaciones de células marcadas diferencialmente, en su caso.
		<ol><li>Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células mixtas con una solución fijadora (1 mL) para los análisis de citometría de flujo posterior.</li>
		</ol></li> <li>Lugar animales donadores en la posición propensa. Aplicar presión caudal suave sobre la piel dorsal a la vista, haciendo que el globo ocular sobresale un poco.</li>
		<li>Dirigir la aguja medialmente e inyectar 100 μl de suspensión de la célula donante retro-orbitally cada ratón receptor. Las células también pueden ser inyectadas a través de la vena de la cola.</li>
		<li>Poco a poco retirar la aguja de inyección y mouse solo en una jaula de recuperación. Animal del monitor hasta que ha recuperado la conciencia; una vez totalmente recuperado retorno del animal a la vivienda social.</li>
	</ol></li> <li>Recogida y análisis de <ol><li>después de 1 h, anestesiar ratones receptores con anestesia isoflurano (1-3%) utilizando un vaporizador, confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. El bazo (u otro tejido de interés) de la cosecha (paso 2.1.2.) de cada lugar en medios completo (1 mL/destinatario) y ratón receptor. Eutanasia a animales anestesiados por degollación. 
		Nota: Intervalos más largos antes de la cosecha de tejido aumentará la acumulación del tejido a través de al menos 24 h.</li>
		<li>Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en completa comunicación con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>4 añadir volúmenes de lisis ACK del almacenador intermediario e incuban 5 min a temperatura ambiente. Centrifugue la suspensión de células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de la tinción buffer (tampón fosfato salino suplementado con 1% FBS). Contar las células y ajustar a una concentración final de 3 x 10 7 células/mL. Transferir 100 μl de la suspensión celular a un pozo 96 placa inferior redondo.</li>
		<li>Tinción de células para marcadores deseadas (véase tabla de materiales) para el análisis por citometría de flujo. Añadir anticuerpos conjugados fluoróforo (véase la tabla de materiales) contra los marcadores deseados e incubar a 4 ° C por 20 min en la oscuridad. Añada 100 μl tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet en 200 μL tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet en la tinción de 125 μl tampón y adquirir muestras utilizando un citómetro de flujo utilizando procedimientos estándar de. 
		Nota: El tinte verde es excitado por un láser 488 y la emisión se detecta con los filtros dicroicos 505 y 530/30. El tinte anaranjado es excitado por un 561 nm y la emisión se detecta por un filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvo las células de 2.1.8.2 para compensar cada colorante fluorescente. 
			Nota: Utilizando compensación de grano con fluoróforos que empareja la excitación y espectros de emisión de los tintes Etiquetadoras dará lugar a indemnización subóptima.</li>
			<li>Utilizar las células entradas guardadas desde el paso 2.2.2.1 para determinar con precisión la relación de marcado diferencialmente células de entrada si utiliza más de una población marcada ( figura 3). Calcular la migración específica de tejido basada en la relación de etiquetado a las células sin etiqueta ( figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Cuantificación de la migración de células inmunes puede lograrse usando simple y rápido de ensayos tanto in vitro como in vivo. Demostramos en vitro la Quimiotaxis de monocitos humanos en respuesta a un gradiente de MCP-1 y aumento por el suero. In vivo, esplenocitos murinos donantes fueron etiquetados diferencialmente y tras transferencia adoptiva, fueron recuperados de los animales receptores.
Usando un lector de placa tiene la ventaja de varios puntos...

Inmunidad sólida requiere la compleja coordinación temporal y espacial de una gran variedad de tipos de la célula para responder adecuadamente a la lesión, la infección y generar autotolerancia. Se han descubierto varios receptores del chemokine docena y sus correspondientes ligandos y mecanismos moleculares que caracterizado por que las células específicas pueden dirigirse en un tejido específico en un momento específico. Así, estudiar la quimiotaxis y migración es un componente indispensable de la investigación de la inmunología. De hecho, el ensayo descrito en vitro recientemente fue utilizado como una herramienta de detección para identificar quimiotáctico cofactor que acelera el quimiotactismo de las células T hacia C-C quimiocinas 19 y 213. El propósito de los métodos descritos aquí son permitir evaluaciones cuantitativas de la Quimiotaxis de células inmunitarias en vitro y en vivo.
El análisis de la cámara de Boyden (migración celular e invasión) es un método rápido, barato y reproducible para evaluar la migración de la célula4,5. En el ensayo estándar, la cámara superior es sembrada con células y está separada por una inserción porosa de una cámara inferior, en el cual las células migran. En el tiempo deseado, las células que han emigrado a la parte inferior de la inserción pueden ser fijo y manchadas para cuantificación por microscopia ligera. Sin embargo, estas mediciones restringen la recopilación de datos para un único punto de la final, que excluye la recolección de datos dinámica y pueden requerir extensa optimización para determinar el momento óptimo para el análisis. Aquí, se describen varias adaptaciones que permiten mediciones en tiempo real, cuantitativas y multiplexadas de quimiotaxis en vitro.
Estudios en vivo , se utiliza un punto funcional, es decir, la acumulación específica de células en un compartimento determinado tejido. Células de un donante previamente etiquetados se introducen animales receptores a través de transferencia adoptiva. Estas células del donante pueden identificarse posteriormente mediante citometría de flujo después de la cosecha de tejido receptor. También es una estrategia Co etiquetada que permite la determinación del tráfico de diferentes tipos de células dentro de un solo animal receptor. Este método elimina la variación entre animal de la inyección de células y representa la variabilidad entre animales fisiológica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Quimiotaxis es la migración a lo largo de un gradiente químico específico1. Quimiocinas son citocinas quimiotácticas que promueven el tráfico celular con especificidad anatómica y temporal2. Chemotaxis es una función crítica de los linfocitos y otras células inmunes que pueden ser cuantitativamente evaluaron in vitro. Este manuscrito describe métodos que permiten la evaluación de la quimiotaxis, en vitro y en vivo, para tipos de diversas células incluyendo líneas celulares y células nativas. El en vitro, formato basado en la placa permite la comparación de varias condiciones simultáneamente en tiempo real y puede terminar dentro de 1-4 h. In vitro ensayo condiciones pueden manipularse para introducir agonistas y antagonistas, como así como diferenciarse quimiotaxis chemokinesis, que es el movimiento al azar. En vivo tráfico evaluaciones, las células inmunes pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes múltiples y utilizan para la transferencia adoptiva. El etiquetado diferencial de células permite que las poblaciones de mezclado de la célula se introduce en el mismo animal, lo que disminuye la varianza y reducir el número de animales requeridos para un experimento estadístico adecuado. Migración en el tejido linfoide ocurre en tan poco como 1 h, y múltiples compartimentos de tejido pueden ser muestreados. Citometría de flujo después de la cosecha de tejido permite un análisis rápido y cuantitativo de los patrones migratorios de múltiples tipos de células.

Cuando se usa tinte de calceína-AM, inspección visual de las células confirmará absorción de etiqueta (figura 1). Lecturas de fluorescentes automatizadas seguimiento migración como tránsito de las células en la parte inferior del parte movible en el tiempo. Estos datos muestran claramente una inducción de la migración celular hacia la MCP-1, así como un aumento de esta respuesta por el suero (figura 2A). Dependiendo de...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K vistas.  The Rockefeller University. Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Video: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

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Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro

Un

Cuantitativo

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

Murina de linfocitos Etiquetado por

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

Cuantificación de la actividad quimiotáctica monocitos en Vivo y caracterización de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos