Nuestra técnica permite la toma de imágenes precisas de células inmunitarias humanas acumuladas en pulmones en condiciones inflamatorias in vivo, proporcionando información interesantes sobre el proceso de localización pulmonar de células T. Este protocolo apoya la investigación traslacional en el rastreo pulmonar de las células T y, por lo tanto, puede ayudar en la identificación de nuevos objetivos para una terapia optimizada de enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas. En particular, la capacidad de considerar la influencia de las propiedades de células inmunitarias específicas de la enfermedad, la organización del tejido pulmonar y el entorno inflamatorio en la localización pulmonar de las células T hace que este método sea altamente ventajoso.
En general, nuestra técnica es de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que a menudo son impulsadas por una abrumadora acumulación de tejido de células inmunitarias activadas. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón C57 negro 6J de al menos 16 gramos, seis semanas de edad, anestesiado, utilice un micropipet para entregar lentamente 10 microlitros de solución de papaína recién preparada en una fosa nasal del ratón una vez al día durante tres días consecutivos. Al día siguiente de la última administración de papaína, capa 10 mililitros de Ficoll medio bajo sangre periférica humana de un voluntario sano pre-diluido en una proporción de uno a dos en PBS para la separación del gradiente de densidad por centrifugación.
Transfiera la célula sanguínea mononuclear periférica o la capa de interfase PBMC a un nuevo tubo de 50 mililitros y recoja las células por centrifugación. A continuación, realice el aislamiento magnético de microperlas de células positivas CD4 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Re-suspendiendo las células T positivas CD4 aisladas del cordón a una hasta una diez veces a las séptimas células T por al menos 500 microlitros de concentración de PBS.
Etiquete las células con un tinte adecuado de proliferación celular excitable de luz roja durante 10 minutos a 37 grados celsius. Al final de la incubación, detener la reacción de etiquetado con cinco volúmenes de RPMI medio complementado con 10%FBS durante cinco minutos en hielo seguido de tres lavados en medio. Para la transferencia adoptiva de los células T positivas CD4 humanas a ratones receptores expuestos a papaína, readhestique las células T etiquetadas fluorescentemente a una concentración de una vez 10 a la séptima célula por mililitro de concentración en PBS y cargue 100 microlitros de células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 por animal receptor, luego inyecte todo el volumen de células de una jeringa en la vena de la cola un animal tratado con papaína manteniendo la aguja de la punta dentro de la vena para un adicional cinco segundos después del parto celular para evitar la descarga de la suspensión celular.
Tres horas después de la transferencia de células adoptivas, perfore el ventrículo derecho de cada ratón eutanizado con una cánula de calibre 21 conectada a un catéter y haga una incisión en el ventrículo izquierdo. Perfunde lentamente el pulmón con 20 mililitros de PBS helado complementado con cinco EDTA milimétricas seguidos por dos mililitros de helado 4%paraformaldehído. Cuando todo el fijador se haya lavado a través del tejido, retire las glándulas salivales y corte el músculo hioides esternal para permitir que un fórceps se deslice debajo de la tráquea para exponer el tejido del tubo de aire.
Realice una punción inicial de la tráquea expuesta con una aguja del calibre 30 antes de reemplazar la aguja con un catéter de calibre 30 para evitar más daños en el tejido. Utilice un soporte de aguja para sellar la unión entre el catéter insertado y la tráquea, y llene cuidadosamente las vías respiratorias con aproximadamente 37 grados Celsius 0.75% de agarosa hasta el despliegue completo del pulmón. Una unión estrecha entre el catéter y la tráquea es fundamental para expandir el pulmón a su tamaño fisiológico y mantener la arquitectura tisular para la toma de imágenes.
Cuando la agarosa se haya solidificado por completo, retire el catéter y transfiera cuidadosamente el pulmón a un tubo oscurecido de dos mililitros lleno de 4%paraformaldehdye. A continuación, deshidratar el tejido con incubaciones secuenciales de etanol bajo rotación continua a 31 rotaciones por minuto y cuatro grados Celsius como se indica durante cuatro horas por incubación. Después de la deshidratación completa, transfiera la muestra a cinnamato etílico para una incubación durante la noche a temperatura ambiente hasta que el tejido aparezca translúcido.
Para una microscopía fluorescente de hoja de luz, utilice una pequeña gota de pegamento estable con disolvente orgánico para pegar el pulmón al soporte de muestra del microscopio y colocar el lóbulo pulmonar en el soporte en posición vertical. Coloque el portacuchillas en su cámara y seleccione los láseres adecuados para el experimento en el software del instrumento. A continuación, utilice los controles deslizantes en Optics para establecer un ancho de hoja que la apertura numérica que revela uniformemente todo el órgano o una sección específica de interés.
Utilice el control deslizante para establecer la intensidad del láser bajo control de transmisión láser para cada láser seleccionado y haga clic en Aplicar. Utilice Configuración de medición avanzada para fusionar las hojas de luz izquierda y derecha para crear una imagen iluminada de forma homogénea. Defina las posiciones inicial y final de la pila Z que se medirán en el rango de escaneo y establezca el tamaño del paso en cinco micrómetros y, a continuación, seleccione autoguardar para guardar los archivos automáticamente e iniciar la medición para capturar las imágenes.
Una vez adquiridas todas las imágenes, active el botón Superar en el software de análisis 3D posterior a la imagen y cargue la primera imagen desde una pila Z para iniciar la apertura y la reconstrucción 3D automática de todas las demás imágenes de la pila Z seleccionada, luego en Ajuste de pantalla, ajuste la intensidad, el nivel de negro y el contraste para cada canal. Para comparar la acumulación de células humanas dentro del tejido pulmonar en diferentes muestras, seleccione Editar y recortar 3D para definir un cubo pulmonar con un volumen específico. Para cuantificar las celdas etiquetadas dentro del cubo pulmonar definido, abra Agregar nuevos puntos en la barra de herramientas, haga clic en Omitir creación automática, edite manualmente y seleccione el canal de 640 nanómetros.
Establezca la escala de radio en 10,00 micras, haga clic en Seleccionar y, en Editar, pulse Mayús y haga clic con el botón izquierdo del ratón para marcar individualmente cada celda con un punto. El número total de celdas contadas se mostrará en las estadísticas. Para capturar una imagen, utilice la herramienta de instantáneas o utilice la herramienta de animación para capturar un vídeo.
El enriquecimiento celular a base de micropera y el posterior etiquetado de fluorescencia, como se demuestra normalmente resultan en una pureza positiva CD4 de al menos el 95% y un etiquetado exitoso de estas células según lo determinado por la citometría de flujo. La limpieza de tejido a base de cinnamato etílico logra un alto nivel de transparencia orgánica que indica una coincidencia exitosa del índice de refracción. La señal auto-fluorescente del tejido pulmonar ofrece una herramienta útil para imaginar la estructura anatómica del pulmón mediante microscopía de hoja de luz que se puede mostrar como una proyección de intensidad media o en modo de superficie.
En comparación con la microscopía convencional, la microscopía de láminas ligeras ofrece la ventaja de la toma de imágenes de órganos enteros y la posterior reconstrucción 3D que permite la identificación y visualización de células T humanas etiquetadas con tinte de proliferación en el contexto de todo el órgano, además, la preferencia de las células T humanas transferidas para la acumulación selectiva dentro del tejido pulmonar inflamado de los animales expuestos a la papaína se apoya aún más en el hecho de que las células T positivas CD4 humanas no se pueden recuperar de la mucosa intestinal. Para la cuantificación y comparación de la acumulación pulmonar de células T positivas CD4 humanas entre diferentes condiciones, las células etiquetadas también se pueden contar en varios cubos pulmonares de volumen definido como se ha demostrado. La preparación cuidadosa de los tejidos, incluida la perfusión pulmonar, la inflación y la limpieza de tejidos, es muy importante para una generación optimizada de imágenes microscópicas de hojas de luz de alta resolución.
Para confirmar aún más la diapedesis exitosa de los linfocitos humanos transferidos, este protocolo se puede combinar fácilmente con la cuantificación citométrica de flujo de linfocitos humanos dentro del lavado broncoalveolar murino. La capacidad de controlar las células inmunitarias derivadas de pacientes individuales en condiciones in vivo apoya la identificación de alteraciones funcionales en las células inmunitarias impresas por una enfermedad o terapia en particular.
