Diese Arbeit wurde von Bernard L. Schwartz Programm für Arzt-Wissenschaftler an der Rockefeller University, des therapeutischen Entwicklungsfonds Robertson an der Rockefeller University und die Sackler Center für Biomedizin und Ernährungsforschung an unterstützt die Rockefeller Universität.

alle Verfahren wurden von der Rockefeller University angenommen &#39; s institutionelle Animal Care und Use Committee. Alle Tiere unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht waren.
 1. Chemotaxis In vitro- <ol><li>Kultur THP-1 Zellen 6 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES; 25 mM) (komplett Media), Aufrechterhaltung der Dichte zwischen 0,5-1,0 x 10 6 Zellen/mL.</li>
	<li>In ein 35-mm-Zellkultur dish, Label 3,5 x 10 5 THP-1 Zellen pro Zustand mit Calcein Acetoxymethyl (Calcein-AM; 2,5 µM) oder anderen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff in komplette Medien bei 37 ° C für 30 min. 
	Hinweis: Farbstoffe müssen Zellmembran durchlässig und mit live-Zelle Kennzeichnung kompatibel sein.</li>
	<li>Pre-warme Platte Leser, 37 ° c 
	Hinweis: Neben der Temperaturregelung ist unten-Lesung Funktionalität auch erforderlich. Siehe Schritt 1.10.2 nach einer Alternative zu einer Platte Leser für die Quantifizierung der Migration Zellen.</li>
	<li>Während Zellen bezeichnen, Vorbereiten der Assay-Platte und Unterhaus.
	<ol><li>Verwendung einer 24-Well-Zellkultur-Platte, mit einer Bedingung pro Bohrloch. Führen Sie jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung.</li>
		<li>Fügen Sie 750 µL Hank &#39; s Buffered Salzlösung (HBSS) gepuffert mit 25 mM HEPES und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), die 24-Well-Platte. Dies dient als der basalen Kontrollbedingung.
		<ol><li>Andere Brunnen für Komparator Bedingungen, immer die Aufrechterhaltung der Gesamtmenge in der unteren Kammer bei 750 µL. 
			Hinweis: In diesem Beispiel dient menschliche Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) als Positivkontrolle für Chemotaxis- 7.
			<ol><li>Montieren die Reagenz Mischung kombiniert HBSS mit 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) und MCP-1 (75 ng/mL). Verwenden Sie Erwachsene bovine Serum (2,7 % V / V) mit MCP-1 als eine zusätzliche Positivkontrolle. 
				Hinweis: Chemokin und Chemokin-Konzentration hängt von der chemotaktische Achse unter Studie. Lyophilisierter MCP-1 ist in destilliertem Wasser mit BSA (0,1 %) zu einer Stammlösung mit einer Endkonzentration von 50 μg/mL Nukleinsäuretablette. Dies kann in Wasser, um eine funktionierende Lösung von 10 μg/mL verdünnt werden. Die untere Kammer 5,6 μL dieser Lösung hinzufügen.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Nach der Besetzung der unteren Kammern abgeschlossen ist, legen Sie einen poröse Einsatz in jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Registerkarten des Einsatzes mit den Kerben der Platte ausrichten. 
		Hinweis: Wählen Sie die geeignete Porengröße für die Einsätze. Für Monozyten und Lymphozyten schneidet gut ab eine Porengröße von 3 μm. Einige Zelltypen und/oder Chemokin-Systeme erfordern eine Matrix-beschichtete Oberfläche für optimale Migration. Zum Beispiel sind für die Messung von THP-1 Monocyte Chemotaxis in Richtung MCP-1, Fibronektin oder Kollagen beschichtet Einsätze empfohlen. Für Platte Leser für Quantifizierung, muss der Einsatz eine Licht-impermeant Beschichtung, wie Polyethylenterephthalat, zur Erkennung von nicht-Migration zu verhindern Zellen in der oberen Kammer 8.</li>
	</ol></li> <li>Nach Inkubation für 30 min mit Calcein-AM Zellen, Zellsuspension auf eine 15mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge Zellen bei 1.000 x g für 2 min. Sichtprüfung Zellen zur Bestätigung der Aufnahme von Calcein-AM ( Abbildung 1).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Vakuum-Sauger. Waschen Sie die markierte Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zellen bei 1.000 x g für 2 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zählen von Zellen und stellen Sie die Lautstärke so, dass die Zellen eine Endkonzentration von 1,0-1,5 x 10 6 Zellen/mL werden.</li>
	<li>Verzichten 250 μl Zellsuspension in die Einlage (Oberhaus).</li>
	<li>, Nachdem alle oberen Kammern gefüllt wurden, sanft heben Sie die Platte und inspizieren die Unterseite für das Vorhandensein von Luftblasen, die Migration und Erkennung stören können. Um eine Blase zu entfernen, versuchen Sie zunächst entfernen, dann Re-Positionierung des Einsatzes. Wenn erfolglos, verwenden Sie eine 27 G Nadel zu punktieren die Blase und dann den Einsatz neu zu positionieren.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den vorgewärmten 37 ° C Platte Leser.
	<ol><li>Acquire Fluoreszenz Lesungen von unten in 1-3 min Abständen. Bei der Verwendung von Calcein-AM festgesetzt der Fluoreszenz Emission und Erregung Wellenlängen 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Je nach Zelle Art und Chemokin Chemotaxis tritt in der Regel über 1-4 h ( Abbildung 2A).</li>
		<li>Als Alternative zur kontinuierlichen Messungen mit einem Teller-Reader, Bild der Brunnen mit einem inversen fluoreszierende Mikroskop ( Abb. 2 b) in der Lage, der Erregung und Detektion von Licht bei 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Verwenden einer niedrigen Vergrößerung, um die Mehrheit an der Unterseite des Einsatzes zu erfassen. Quantifizieren der Zellen durch die Verarbeitung der Bilder mit ImageJ oder ähnliche Software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Adoptiveltern übertragen der murinen Lymphozyten <ol><li>Vorbereitung der Spenderzellen <ol><li>Anesthetize 8-12 Woche-alten C57BL/6J männliche Spender Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers. Angemessene Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage. Machen Sie eine Mittellinie Inzision mit einem Skalpell und suchen Sie die Milz in der oberen linken peritonealen Raum. Verbrauchssteuern Sie die ganze Milz und in komplette Medien (RPMI ergänzt mit 10 % FBS und 25 mM HEPES; 1 mL/Milz) auf Eis. Narkotisierten Spendertiere durch Enthauptung einschläfern.</li>
		<li>Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien (1 mL /spleen) mit dem Ende des einen Spritzenkolben eine 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.</li>
		<li>Fügen Sie 4 Bände von Ammoniumchlorid Kalium (ACK) Lyse Puffern und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, Erythrozyten zu lysieren.</li>
		<li>Der Zellen bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur Zentrifugieren und überstand verwerfen. Wenn Erythrozyten im Pellet bleiben, Aufschwemmen im ACK Lyse Puffer, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, Zentrifugieren Zellen bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen in komplette Medien in einer Konzentration von 2-5 x 10 7 Zellen/mL, dann abgießen die Zellsuspension durch eine 40 µm-Nylon-Netzgewebe, Zelle Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Etikett 1 x 10 7 Zellen/Empfänger Maus mit einem Fluoreszenzfarbstoff kompatibel mit Leben Zellen und bei der anschließenden Fixierung, wie z. B. 5-Chloromethylfluorescein Diacetat (Endkonzentration 2 μM) 10 einbehalten . Inkubation bei 37 ° C für 30 min. 
		Hinweis: Um mehr als eine Zellenbevölkerung zu verfolgen, verwenden Sie andere Fluoreszenzfarbstoffe mit zusätzlichen Zellpopulationen. Zum Beispiel kann ein Teil der Spenderzellen mit 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) Benzoyl gelabelt) amino) Tetramethylrhodamine (Endkonzentration 2 μM) 11.</li>
		<li>Fügen Sie 4 Bände mit HBSS ergänzt 25 mM HEPES, dann Zentrifuge bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie Pellet in HBSS ergänzt mit HEPES 25 mM, eine Endkonzentration von 1 x 10 8 Zellen/mL.
		<ol><li>Wenn mehr als ein Fluoreszenzfarbstoff zu verwenden, halten Sie Zell-Populationen bis unmittelbar vor der Injektion getrennt.</li>
			<li>Eine kleine aliquoten (10 μl) der Zellen von jeder Farbe auf eine Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Entschädigung übertragen.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Übertragung von Lymphozyten <ol><li>8-12 Wochen zu betäuben-alte C57BL/6J männliche Empfänger Mäuse mit Isofluran (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers; Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Tier Tierarzt Salbe zuweisen &#39; s Augen austrocknen zu verhindern.</li>
		<li>Kurz Wirbel Spenderzellen (1 s) und Transfer zum 1 mL Injektionsspritze mit 27 G, 0,5 in Nadel, differentiell beschrifteten Zellpopulationen zu kombinieren, wenn anwendbar.
		<ol><li>Eine kleine aliquoten (10 μl) gemischte Zellen auf einem Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Analysen übertragen.</li>
		</ol></li> <li>Spendertiere in Bauchlage zu platzieren. Milde kaudalen Druck auf die Haut dorsalen für das Auge, verursacht den Augapfel leicht hervorstehen.</li>
		<li>Direkt die Nadel medial und 100 µL Zellsuspension Spender Retro-Orbital in jeder Empfänger Maus injizieren. Zellen können auch über die Rute Vene injiziert werden.</li>
		<li>Allmählich zurückziehen die Injektionsnadel und Maus allein in einem Recovery-Käfig. Tier zu überwachen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat; einmal vollständig wiederhergestellten Rückkehr des Tieres zu Sozialwohnungen.</li>
	</ol></li> <li>Sammlung und Analyse <ol><li>nach 1 h, Empfänger Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) mit einem Vaporizer zu betäuben, Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Die Milz (oder anderes Gewebe von Interesse) zu ernten (Schritt 2.1.2.) von jedem Empfänger Maus und Ort in die komplette Medien (1 mL/Empfänger). Narkotisierten Tieren durch Enthauptung einschläfern. 
		Hinweis: Längere Intervalle vor der Ernte Gewebe erhöht Gewebe Akkumulation durch mindestens 24 Std.</li>
		<li>Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien mit dem Ende des einen Spritzenkolben 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.</li>
		<li>Fügen Sie 4 Bände der ACK Lyse Puffer und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren die Zellsuspension bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur und überstand verwerfen.</li>
		<li>Aufschwemmen Zellen in der Färbung Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ergänzt mit 1 % FBS). Zellen zu zählen und auf eine Endkonzentration von 3 x 10 7 Zellen/mL einstellen. 100 µL Zellsuspension auf einer 96-Well Runde Bodenplatte übertragen.</li>
		<li>Fleck Zellen für gewünschte Markern (siehe Tabelle Material) für die Analyse von Durchflusszytometrie. Fluorophor-konjugierten Antikörpern (siehe die Tabelle Materialien) gegen die gewünschten Markierungen hinzufügen und bei 4 ° C für 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Hinzufügen von 100 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.</li>
		<li>Aufschwemmen das Pellet in 200 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.</li>
		<li>Das Pellet in 125 µL Färbung Aufschwemmen Puffern und Proben mit einem Durchflusszytometer mit Standardverfahren zu erwerben. 
		Hinweis: Der grüne Farbstoff ist begeistert von einem 488 nm Laser und die Emission mit 505 und 530/30 dichroitische Filter erkannt wird. Die orange Farbe ist begeistert durch eine 561 nm und die Emission von 582/15 dichroitische Filter erfasst wird.
		<ol><li>Verwendung gespeichert Zellen aus 2.1.8.2 Ausgleich für jede Fluoreszenzfarbstoff. 
			Hinweis: Mit Wulst-Vergütung mit Fluorophore passend zur Erregung und Emissionsspektren der Kennzeichnung Farbstoffe in suboptimalen Entschädigung führen wird.</li>
			<li>Verwenden die gespeicherten Eingabezellen aus Schritt 2.2.2.1 genau zu bestimmen, das Verhältnis von differentiell Eingabezellen beschriftet, wenn mehr als eine beschriftete Bevölkerung ( Abbildung 3). Berechnen Gewebe spezifische Migration basierend auf dem Verhältnis von beschriftet, unbeschriftete Zellen ( Abbildung 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Quantifizierung der Immunzelle Migration kann erreicht werden, mit einfachen und schnellen Tests in Vitro und in Vivo. Wir zeigen die in Vitro Chemotaxis von menschlichen Monozyten als Reaktion auf eine MCP-1 Steigung und Vermehrung von Serum. In Vivo, Spender murinen Splenocyten waren differentiell beschriftet und anschließend Adoptiveltern waren Empfänger Tiere erholt.
Mit einem Teller-Reader hat den Vorteil, mehrere Zeit Probenahmestellen (so oft wie al...

Robuste Immunität erfordert die komplexe zeitliche und räumliche Koordination einer Vielzahl von Zelltypen, um entsprechend reagieren auf eine Verletzung, Infektion und Selbsttoleranz erzeugen. Mehrere Dutzend Chemokin-Rezeptoren und ihrer entsprechenden Liganden wurden entdeckt und charakterisierte die molekulare Mechanismen durch den spezifischen Zellen können zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem bestimmten Gewebe geleitet werden. Studium Chemotaxis und Migration ist somit ein unverzichtbarer Bestandteil der Immunologie Forschung. In der Tat wurde der beschriebenen in-vitro- Test vor kurzem als Screening-Instrument zur chemotaktische Cofaktor zu identifizieren, die Chemotaxis von T-Zellen in Richtung C-C Chemokine 19 und 213beschleunigt. Der Zweck der hier beschriebenen Methoden sind quantitative Bewertungen der Immunzelle Chemotaxis in Vitro und in Vivozu ermöglichen.
Die Boyden (Zelle Migration und Invasion) Kammer-Assay ist eine kostengünstige, reproduzierbare und schnelle Methode für die Bewertung der Zelle Migration4,5. In der standard-Assay die obere Kammer ist mit Zellen ausgesät, und ist durch eine poröse Einlage aus einem unteren Kammer, in die die Zellen Wandern getrennt. Zum gewünschten Zeitpunkt können Zellen, die an der Unterseite des Einsatzes migriert wurden behoben und gebeizt für Quantifizierung von Lichtmikroskopie. Jedoch solche Messungen Datenerhebung auf einer einzigen Endpunkt, der dynamische Datenerfassung schließt zu beschränken und können erfordern umfangreiche Optimierung den optimale Zeitpunkt für die Analyse zu bestimmen. Hier werden verschiedene Anpassungen beschrieben, die in Echtzeit, quantitative und Multiplex Messungen der Chemotaxis in Vitrozu ermöglichen.
Für in Vivo Studien ist ein funktionelle Endpunkt verwendet, nämlich die spezifischen Anhäufung von Zellen in einem bestimmten Gewebe-Fach. Bereits beschriftete Spenderzellen werden in Empfänger Tiere durch Adoptiveltern Transfer eingeführt. Diese Spenderzellen können anschließend durch Durchflusszytometrie nach Empfänger Gewebe Ernte identifiziert werden. Auch ist eine Co Kennzeichnung Strategie, die für die Bestimmung des Handels mit verschiedenen Zelltypen innerhalb einer einzigen Empfänger Tier erlaubt. Diese Methode beseitigt die Inter Tiere Variation aus Zelle Injektion und Konten für physiologische Variabilität zwischen Tier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Chemotaxis ist die Migration auf eine spezifische chemische Gradienten1. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die Förderung der zellulären Menschenhandel mit anatomischen und zeitlichen Spezifität2. Chemotaxis ist eine kritische Funktion von Lymphozyten und anderen Immunzellen, die quantitativ bewertet in Vitro. Dieses Manuskript beschreibt Methoden, die die Beurteilung der Chemotaxis, erlauben sowohl in Vitro und in Vivo, für unterschiedliche Zelltypen, einschließlich Zell-Linien und native Zellen. Die in-vitro-, Platte-basiertes Format ermöglicht den Vergleich von mehreren Bedingungen gleichzeitig in Echtzeit und können innerhalb von 1-4 h. In Vitro Assay Bedingungen manipuliert werden, vorzustellen, Agonisten und Antagonisten, wie erfolgen sowie unterscheiden Sie Chemotaxis von Chemokinese, ist die zufällige Bewegung. Für in Vivo Menschenhandel Bewertungen können für Adoptiveltern übertragen Immunzellen mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert und verwendet werden. Die unterschiedliche Kennzeichnung von Zellen ermöglicht gemischte Zellpopulationen im selben Tier, dadurch abnehmende Varianz und Reduzierung der Anzahl der Tiere für ein angemessen angetriebene Experiment eingefügt werden soll. Migration in lymphatischen Gewebe tritt in weniger als 1 h, und mehrere Gewebe Fächer können Sie probieren. Durchflusszytometrie Gewebe Ernte folgt ermöglicht eine schnelle und quantitative Analyse der wandernden Muster aus mehreren Zelltypen.

Bei der Verwendung von Calcein-AM Farbstoff bestätigen Sichtprüfung der Zellen Label Aufnahme (Abbildung 1). Automatisierte fluoreszierende Lesungen werden Migration als Zellen Transit auf der Unterseite des Einsatzes im Laufe der Zeit verfolgen. Diese Daten zeigen eindeutig eine Induktion der Zellwanderung in Richtung MCP-1 sowie eine Aufwertung dieser Reaktion durch Serum (Abbildung 2A). Je nach Stärke des wandernden Stimulu...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Aufrufe.  The Rockefeller University. Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Serie: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.