עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית ברנרד שוורץ ל' עבור הרופא מדענים האוניברסיטה רוקפלר, הקרן לפיתוח טיפולית רוברטסון באוניברסיטה רוקפלר, ואת מרכז ע ש סאקלר וההתערבות ומחקר תזונה- אוניברסיטת רוקפלר.

כל ההליכים אושרו על-ידי אוניברסיטת רוקפלר &#39; s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. כל החיות שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.
 1-ב חוץ גופית כימוטקסיס <ol><li>תרבות THP-1 תאים 6 בשנת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI 1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 מ מ) (להשלים מדיה), שמירה על הצפיפות בין 0.5-1.0 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	צלחת <li>תרבית תאים 35 מ מ, תווית 3.5 x 10 תאים 5 THP-1 לכל תנאי עם acetoxymethyl calcein (calcein-אם; 2.5 מיקרומטר) או אחרים מתאימים הפלורסנט בתקשורת מלאה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
	הערה: צבעי חייב להיות קרום התא-חדיר ותואמת לחיות תאים תיוג.</li>
	<li>חם מראש קורא צלחת כדי 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: בנוסף בקרת טמפרטורה, פונקציונליות התחתון-קריאה נדרש גם. ראה שלב 1.10.2 עבור אלטרנטיבה קורא צלחת על כימות של נדידת תאים.</li>
	<li>בעוד תאים הם תיוג, להכין את צלחת assay והרכבים נמוך.
	צלחת <ol><li>שימוש בתרבות רקמה 24-. טוב, בתנאי אחד לכל טוב. לבצע כל תנאי דולר.</li>
		<li>750 להוסיף µL של האנק &#39; s Buffered תמיסת מלח (HBSS) באגירה מלאה עם 25 מ מ HEPES ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) לצלחת 24-. טוב. זה משמש התנאי שליטה הבזליים.
		<ol><li>שימוש אחרים בארות תנאים השוואה, תמיד שמירה לנפח הכללי בתא התחתון-750 µL. 
			הערה: בדוגמה זו, האדם מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) משמש הפקד חיובי עבור כימוטקסיס 7.
			<ol><li>להרכיב התערובת מגיב על-ידי שילוב HBSS עם 25 מ מ HEPES, BSA (0.1%) ו MCP-1 (75 ng/mL). להשתמש בסרום שור למבוגרים (2.7% v / v) עם MCP-1 כפקד חיוביים נוספים של. 
				הערה: ריכוז כימוקין כימוקין יהיה תלוי על ציר chemotactic במחקר. Lyophilized MCP-1 resuspended מים מזוקקים עם BSA (0.1%) כדי להפוך פתרון מניות עם ריכוז סופי של 50 μg/mL. זה יכול להיות מדולל במים לפתרון עבודה של 10 μg/mL. להוסיף 5.6 μL של פתרון זה לתא התחתון.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>בתום ההרכב של התאים התחתון, במקום הוספה נקבובי כל טוב, ולהבטיח הכרטיסיות של הקדמי ליישר עם החריצים של הצלחת- 
		הערה: בחר את גודל הנקבוביות המתאים עבור מוסיף. עבור ומונוציטים ו לימפוציטים, גודל הנקבוביות של 3 μm מבצע טוב. כמה סוגי תאים ו/או מערכות כימוקין עשויים לדרוש משטח מצופה מטריקס עבור העברה אופטימלית. לדוגמה, למדידת THP-1 כימוטקסיס מונוציט לכיוון MCP-1, fibronectin או מוסיף מצופים קולגן מומלצים. צלחת קורא עבור כימות, הוסף חייבת להיות ציפוי impermeant-אור, כגון פוליאתילן terephthalate, כדי למנוע גילוי של אי-העברת תאים העליונה הקאמרית 8.</li>
	</ol></li> <li>לאחר המקננת תאים למשך 30 דקות עם calcein-AM, להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב- 1000 g x עבור 2 דק לבדוק חזותית תאים כדי לאשר ספיגת של calcein-אם ( איור 1).</li>
	<li>הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק. רחץ תאים עם תוויות ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאים ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. לספור תאים, לכוונן את עוצמת הקול כך התאים נמצאים ריכוז סופי של 1.0-1.5 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	<li>250 לוותר על μL של התליה תא לתוך תותב (העליון קאמרית).</li>
	<li>לאחר כל צ'יימברס העליון היו מלאים, בעדינות להרים את הצלחת לבדוק את החלק התחתון לנוכחות של בועות אוויר שעלולות לפגוע ההעברה וזיהוי. כדי להסיר בועה, נסה תחילה הסרת ואז מיצוב מחדש את תותב. אם לא מוצלח, שימוש במחט 27 G לנקב את הבועה ולאחר מכן מקם מחדש את תותב.</li>
	<li>למקם את הצלחת לקורא צלחת מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס.
	<ol><li>רכוש קריאות קרינה פלואורסצנטית מלמטה במרווחים 1-3 דקות. בעת השימוש calcein-AM, הגדר קרינה פלואורסצנטית אורכי גל עירור, פליטה-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. בהתאם למערכת כימוקין וסוג התא, כימוטקסיס מתרחשת בדרך כלל יותר מ 1-4 h ( איור 2 א).</li>
		<li>כחלופה מדידות רציף באמצעות קורא-צלחת, תמונה הבארות באמצעות הפוכה פלורסנט במיקרוסקופ ( איור 2B) מסוגל עירור וזיהוי של אור-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. השתמש הגדלה נמוכה כדי ללכוד את רוב החלק התחתון של הקדמי. לכמת תאים על-ידי עיבוד התמונות עם ImageJ או תוכנה דומה 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. המאמצים העברה של מאתר לימפוציטים <ol><li>הכנה תאי התורם <ol><li>Anesthetize בשבוע 8-12-C57BL/6J הישן תורם זכר עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של. לאשר עומק ההרדמה המתאימה על ידי הבוהן-קמצוץ.</li>
		<li>הנח את העכבר במצב פרקדן. עושים חתך קו האמצע עם איזמל ואתר הטחול בחלל הצפק השמאלי העליון. לסלק כל הטחול, למקם את המדיה מלאה (RPMI בתוספת 10% FBS עד 25 מ מ HEPES; 1 mL/טחול) על קרח. המתת חסד התורם מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.</li>
		<li>לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה (1 מ"ל /spleen) באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים של אמוניום כלוריד האשלגן (ACK) פירוק מאגר ואת תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse אריתרוציטים.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נשארים בגדר, resuspend במאגר פירוק ACK, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend התאים בתקשורת מלאה-ריכוז של 2-5 x 10 7 תאים למ"ל, ואז מסננים התליה תא דרך רשת ניילון 40 µm כדי להסיר שאריות תאים.</li>
		<li>תווית 1 x 10 7 תאים/נמען עכבר עם תואם הפלורסנט חיים תאים, זה יוסיף להישמר על קיבוע עוקבות, כגון 5-chloromethylfluorescein diacetate (ריכוז סופי 2 μM) 10 . דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
		הערה: כדי לעקוב אחר אוכלוסיית תא אחד או יותר, השתמש אחרים צבעי פלורסנט עם אוכלוסיות תאים נוספים. For example, חלק של תאי התורם יכול להיות מסומן באמצעות בנזואיל 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) אמינו) tetramethylrhodamine (ריכוז סופי 2 μM) 11-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים HBSS בתוספת 25 מ מ HEPES, ולאחר מכן צנטריפוגה ב g 1,000 x עבור 2 דקות ו להשליך תגובת שיקוע. Resuspend צנפה ב HBSS בתוספת HEPES 25 מ"מ עד ריכוז סופי של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל....
		<ol><li>אם משתמש אחד או יותר הפלורסנט, לשמור על אוכלוסיות תאים מופרדים עד מייד לפני הזרקת.</li>
			<li>העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים של כל צבע פתרון מקבע (1 מ"ל) פיצויים cytometry זרימה עוקבות.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>העברה של לימפוציטים <ol><li>עזים ומתנגד בשבוע 8-12-בת C57BL/6J זכר הנמען עכברים עם איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. חלות וטרינרי משחה חיה &#39; s עיניים כדי למנוע ייבוש.</li>
		<li>בקצרה מערבולת תורם תאי (1 s), העברת 1 מ"ל הזרקת מזרק עם G 27, 0.5 ב המחט, שילוב אוכלוסיות תאים עם תוויות באופן שונה, אם הדבר ישים.
		<ol><li>העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים מעורב פתרון מקבע (1 מ"ל) עבור ניתוחים cytometry זרימה עוקבות.</li>
		</ol></li> <li>מקום חיות לתורם בשכיבה. הפעילו לחץ מתון סימטרית על העור הגבי לעין, גורם של גלגל העין לבלוט מעט.</li>
		<li>לכוון את המחט medially, להזריק 100 µL של התורם תא השעיה רטרו-orbitally לתוך עכבר לכל הנמענים. גם יכול להיות מוזרק התאים דרך הווריד זנב של.</li>
		<li>בהדרגה לשלוף את המחט הזרקה, הנח העכבר לבד בתוך כלוב ההתאוששות. צג חיה עד זה שהכרתו; שהחלמת באופן מלא פעם לשוב החיה דיור חברתי.</li>
	</ol></li> <li>איסוף וניתוח <ol><li>לאחר 1 h, עזים ומתנגד הנמען עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. הקציר הטחול (או רקמות אחרות עניין) (שלב 2.1.2.) של כל הנמענים העכבר ומקום לתוך המדיה מלאה (mL/נמען 1). המתת חסד מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש. 
		הערה: מרווחי לפני הקציר רקמות יגדל הצטברות רקמת דרך לפחות 24 ח'</li>
		<li>לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים של פירוק ACK מאגר, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge התליה תא ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		מאגר <li>תאים resuspend מכתים (תמיסת מלח באגירה פוספט בתוספת 1% FBS). לספור תאים ולהתאים את ריכוז הסופי של 3 x 10 7 תאים/מ ל.... להעביר 100 µL תא השעיה 96-ובכן סביב הצלחת התחתונה.</li>
		<li>הכתם תאים עבור סמני הרצוי (ראה טבלה של החומרים) לניתוח על ידי cytometry זרימה. מוסיפים נוגדנים fluorophore מצומדת (ראה טבלה של החומרים) נגד הסמנים הרצויים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. להוסיף 100 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 200 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 125 µL מכתים מאגר ולרכוש דוגמאות שימוש cytometer זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים. 
		הערה: הצבע הירוק הוא נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר, הפליטה ומתגלה עם מסננים ודיקרואיק זוהר 505 ו- 530/30. הצבע הכתום נרגש 561 nm ו הפליטה מזוהה באמצעות מסנן ודיקרואיק זוהר 582/15.
		<ol><li>שימוש הציל תאים מכל 2.1.8.2 כדי לפצות על כל הפלורסנט. 
			הערה: באמצעות פיצוי מבוסס-חרוז עם fluorophores תואמים את עירור ואת ספקטרום הפליטה של צבעים תיוג תגרום פיצוי שיוצרת.</li>
			<li>השתמש תאי קלט ששמרת משלב 2.2.2.1 במדויק לקבוע את היחס שבין באופן שונה עם התווית תאי קלט אם משתמש אחד או יותר שכותרתו האוכלוסייה ( איור 3). לחשב רקמות ספציפיות ההעברה המבוססים על היחס של תווית לתאים ללא תווית ( איור 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

כימות של נדידת תאים חיסוניים יכול להתבצע באמצעות פשוטה, מהירה מבחני גם בתוך vitro וגם ויוו. נדגים את כימוטקסיס במבחנה של ומונוציטים האדם בתגובה שיפוע MCP-1 ו הגדלת מאת סרום. In vivo, splenocytes מאתר התורם באופן שונה עם תווית, בעקבות העברת המאמצת, ששוחזרו מחיות הנמען.
ש?...

חסינות חסון דורש התיאום הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית מורכב של מספר עצום של סוגי תאים על מנת להגיב כראוי על פציעה, זיהום, ליצור self-tolerance. מספר הקולטנים כימוקין עשרות וליגנדים המקביל שלהם התגלו, המנגנונים המולקולריים מתן מאופיין על ידי אילו תאים מסוים ויכולה להיות מכוונת לתוך רקמה ספציפית בזמן מסוים. לפיכך, לומד כימוטקסיס והעברה היא מרכיב הכרחי של מחקר באימונולוגיה. אכן, וזמינותו שתואר במבחנה לאחרונה שימשה ככלי מיון לזיהוי קופקטור chemotactic שמאיץ כימוטקסיס של תאי-T לכיוון נוגדנים 19 ו- 21 C-C3. מטרת בשיטות המתוארות כאן הם להתיר הערכות כמותיות של תאים חיסוניים כימוטקסיס במבחנה , בתוך vivo.
וזמינותו קאמרית בוידן (נדידת תאים, הפלישה) היא שיטה זולה, הדירים מהירה להערכת תא העברה4,5. ב וזמינותו סטנדרטי, התא העליון הוא נזרע עם תאים, מופרדת באמצעות הוספה נקבובי מ. התא התחתון, שאליו העברת התאים. בזמן הרצוי, תאים היגרו בצד התחתון של הקדמי יכול להיות קבוע, עבור כימות מוכתמת מיקרוסקופ אור. אולם, מדידות כאלה להגביל איסוף נתונים נקודת סיום יחיד, שמונע את איסוף נתונים דינאמי, באפשרותך לדרוש אופטימיזציה מקיפה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלי לניתוח. . הנה, מספר עיבודים מתוארים כי היתר בזמן אמת, כמותיים, מרובבת מדידות של כימוטקסיס במבחנה.
ללימודים ויוו , משמש נקודת סיום פונקציונלית, כלומר הצטברות תאים בתא רקמות נתון ספציפי. תאי התורם מראש שכותרתו יוכנסו חיות נמען באמצעות העברת המאמצת. אלה בתאי התורם לאחר מכן ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות הנמען. הציג גם היא אסטרטגיה משותפת תיוג המאפשר קביעת סחר לסוגי תאים שונים בתוך חיה נמען בודד. שיטה זו מבטלת את הווריאציה בין בעלי חיים הזרקת תאים, ואת חשבונות עבור הפיזיולוגיות השתנות בין בעלי חיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

כימוטקסיס הוא העברה לאורך כימי מסוים מעבר צבע1. נוגדנים הם ציטוקינים chemotactic לקדם סחר הסלולר עם ירידה לפרטים אנטומיים, זמני2. כימוטקסיס הוא פונקציה קריטית של לימפוציטים, תאים חיסוניים אחרים זה יכול להיות באופן כמותי מוערך ב חוץ גופית. כתב יד זה מתאר שיטות המתירים הערכת כימוטקסיס, גם במבחנה וגם ויוו, עבור סוגי תאים מגוונים כולל שורות תאים ותאים מקורית. ה במבחנה, עיצוב מבוסס על צלחת מאפשר השוואת בו-זמנית בתוך מספר תנאים בזמן אמת, ואת יכולה להסתיים תוך 1-4 ח' במבחנה assay תנאים ניתן לטפל להציג אגוניסטים ו antagonists, כמו גם להבדיל כימוטקסיס chemokinesis, וזו תנועה אקראית. עבור ויוו הערכות סחר, תאים חיסוניים יכול להיות עם צבעי פלורסנט מרובים תוויות, המשמש להעברת המאמצת. תיוג דיפרנציאלית של תאים מאפשר לאוכלוסיות לתא מעורב להיות מוחדרים החיה אותו, ובכך להקטין את השונות, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים עבור ניסוי מופעל כראוי. הגירה לתוך רקמת הלימפה מתרחשת בתוך פחות משעה ולאחר מספר תאי רקמות ניתן לטעום. Cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות מאפשר ניתוח מהיר ולא כמותית של דפוסי הנדידה סוגי תאים מרובים.

בעת שימוש calcein-אם צבע, בדיקה ויזואלית של תאים יאשר תווית ספיגת (איור 1). קריאות פלורסנט אוטומטיות יעקבו הגירה כמו תאי המעבר אל החלק התחתון של הקדמי לאורך זמן. נתונים אלו מראים בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לכיוון MCP-1, כמו גם על הגדלת של תגובה זו על ידי סרום (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Views.  The Rockefeller University. פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

Video: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה

כמותי

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

Murine לימפוציטים תיוג ידי

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט