Bu eser Bernard L. Schwartz Program tarafından Rockefeller Üniversitesi, Robertson terapötik geliştirme Fonu, Rockefeller Üniversitesi ve Sackler Merkezi'nde hekim bilim adamları için Biyomedikal ve beslenme araştırmaları için desteklenen Rockefeller Üniversitesi.

tüm yordamları Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır &#39; s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza.
 1. In Vitro kemotaksisi <ol><li>kültür THP-1 hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve 4-(2-hydroxyethyl) -1 ile 6 ' Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640)- piperazineethanesulfonic asit (HEPES; 25 mM) (tamamlamak medya), 0.5-1.0 x 10 6 hücre/mL arasında yoğunluk bakımı.</li>
	<li>İçinde bir 35 mm hücre kültürü çanağı, koşulu ile calcein acetoxymethyl (calcein-AM; 2.5 µM) veya diğer uygun floresan boya tam medya 37 ° C'de 30 dakika süreyle başına etiket 3.5 x 10 5 THP-1 hücre 
	Not: Boyalar hücre membran geçirgen ve canlı hücre etiketleme ile uyumlu olmalıdır.</li>
	<li>Öncesi sıcak plaka okuyucu 37 ° c 
	Not: sıcaklık kontrolü yanı sıra, alt-okuma işlevi de gereklidir. Geçiş adım 1.10.2 plaka okuyucu miktar için bir alternatif için bkz: hücre.</li>
	<li>Hücreleri etiketleme iken, tahlil plaka ve alt odası hazırlamak.
	<ol><li>Kullanım 24-iyi doku kültürü plakalı iyi başına tek bir şartla. Her koşul nüsha gerçekleştirmek.</li>
		<li>Ekleyin 750 µL Hank, &#39; s 25 mM HEPES ve % 0.1 sığır serum albümin ile (BSA) 24-şey plakasına arabelleğe Buffered tuz solüsyonu (HBSS). Bu Bazal denetim koşulu olarak hizmet vermektedir.
		<ol><li>Kullanımı diğer kuyular karşılaştırıcı koşullar, her zaman toplam 750 µL adlı alt Kamara hacmindeki sürdürmek için. 
			Not: Bu örnekte, insan monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) kemotaksisi 7 için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
			<ol><li>Araya reaktif karışımı ile birleştirerek 25 mM HEPES ile HBSS, BSA (% 0,1) ve MCP-1 (75 ng/mL). Yetişkin sığır serum kullanın (% 2.7 v / v) MCP-1 ek bir olumlu denetim olarak. 
				Not: Kemokin ve Kemokin konsantrasyon kemotaktik ekseni altında eğitim bağlı olacaktır. Liyofilize MCP-1 50 μg/mL nihai bir konsantrasyon ile hisse senedi bir çözüm sağlamak için BSA (%0.1) ile distile suda resuspended. Bunun için çalışan bir çözüm olarak 10 μg/mL suda seyreltilmiş. Bu çözümün 5.6 μL alt odasına ekleyin.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Alt chambers bileşimi tamamlandıktan sonra her şey sekmeler ekleme plaka çentikler ile hizalamak sağlanması, gözenekli bir INSERT yerleştirin. 
		Not: için ekler uygun gözenek boyutu seçin. 3 mikron gözenek boyutunu monosit ve lenfositler için iyi bir performans sergiliyor. Bazı hücre tipleri ve/veya Kemokin sistemleri bir matris kaplı yüzey en iyi geçiş için gerekebilir. Örneğin, THP-1 monosit kemotaksisi MCP-1 doğru ölçmek için fibronektin veya ekler kolajen kaplı önerilir. Nefelometri için plaka okuyucu için ekleme, polietilen tereftalat gibi bir ışık impermeant kaplama sigara geçiş olarak algılanmasını önlemek için olması gerekir hücrelerin üst odası 8.</li>
	</ol></li> <li>Hücreler ile calcein-AM 30 dk için kuluçka sonra hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak. 1000 x g 2 dakika süreyle santrifüj hücreleri kontrol edin calcein-AM ( şekil 1) alımını onaylamak için hücreleri.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant çıkarın. Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 etiketli hücreleri yıkayın. Santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
	<li>Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 hücrelerde resuspend. Say hücreleri ve böylece hücreleri 1.0-1.5 x 10 6 hücre/mL nihai bir konsantrasyon, ses seviyesini.</li>
	<li>Hücre süspansiyon Ekle (üst Kamara) içine dağıtmak 250 μL.</li>
	Sonra tüm üst odaları doldurulmuş, yavaşça plaka kaldırın ve alt geçiş ve algılama ile girişime neden olabilir hava kabarcıkları varlığı için kontrol edin <li>. Bir kabarcık kaldırmak için ilk önce Ekle yeniden konumlandırma kaldırmayı deneyin. İşlem başarısız olursa, kabarcık ponksiyon ve ekleme yeniden konumlandırmak için 27 G iğne kullanın.</li>
	<li>Plaka Önceden ısıtılmış 37 ° C plaka okuyucuya yerleştirin.
	<ol><li>Edinme Floresans okuma 1-3 dk aralıklarla alttan. Calcein-AM kullanırken, Floresans 485 uyarma ve emisyon dalga boylarında ayarla nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Hücre türü ve Kemokin sistemine bağlı olarak, kemotaksis genellikle 1-4 h ( şekil 2A) üzerinden ortaya çıkar.</li>
		<li>Sürekli ölçümler alternatif olarak plaka okuyucu kullanarak görüntü bir ters floresan mikroskop ( şekil 2B) uyarma ve ışık algılama yeteneğine sahip 485 kullanarak wells nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Düşük bir büyütme alt ucun çoğunluğu yakalamak için kullanın. Hücreleri ImageJ veya benzer yazılım 9 görüntülerle işleyerek ölçmek.</li>
	</ol></li></ol> 2. Evlat edinen Transfer, fare lenfosit <ol><li>donör hücreleri hazırlanması <ol><li>Anesthetize 8-12 hafta-bir Buharlaştırıcı kullanarak isoflurane anestezi (% 1-3) ile eski C57BL/6J erkek donör fareler. Toe-çimdik tarafından uygun anestezi derinliği onaylayın.</li>
		<li>, Sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Bir ensizyon bir neşter ile yapmak ve dalak üst sol Periton boşluğu bulun. Bütün dalak tüketim ve buz üzerinde tam medya (%10 FBS ve 25 mM HEPES RPMI; 1 mL/dalak) yerleştirin. İmzalat donör hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi.</li>
		<li>Komple medya (1 mL /spleen) bir tek hücre süspansiyon ve transfer 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak içine grind dalak doku 40 µm naylon mesh hafifçe ile.</li>
		<li>Amonyum klorür potasyum (ACK) lizis eklemek 4 hacimleri tampon ve eritrositler koşullar için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2 min için 1000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Eritrositler Pelet içinde kalırsanız, ACK lizis arabellekte resuspend, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya, santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>2-5 x 10 7 hücre/mL bir konsantrasyon, komple medya hücrelerde resuspend, daha sonra hücre süspansiyon hücre artıkları kaldırmak için 40 µm naylon mesh ile süzün.</li>
		5-chloromethylfluorescein diacetate (son konsantrasyonu 2 mikron) 10 gibi sonraki fiksasyon üzerine korunur ve <li>Etiket 1 x 10 7 hücreler/alıcı fare ile floresan boya ile uyumlu hücreleri canlı . 30 dakika süreyle 37 ° C'de kuluçkaya 
		Not: birden fazla hücre nüfus izlemek için ek hücre popülasyonlarının ile diğer floresan boyalar kullanın. Donör hücreleri bir kısmını 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoil ile şekillendirebilir etiketlenir) amino) tetramethylrhodamine (son konsantrasyonu 2 mikron) 11.</li>
		<li>Eklemek 4 birimleri ile HBSS takıma 25 mM HEPES, sonra 2 dk ve atma süpernatant için 1000 x g, santrifüj. Pelet HEPES 25 mM için 1 x 10 8 hücre/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma HBSS resuspend.
		<ol><li>Birden fazla floresan boya kullanıyorsanız, hemen önce enjeksiyon kadar ayrılmış hücre popülasyonlarının devam.</li>
			<li>Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi tazminat için bir sabitleştirici çözüm (1 mL) her renk hücrelerinin transfer.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Lenfositler transfer <ol><li>8-12 hafta anestezi-eski C57BL/6J erkek alıcı fareler bir Buharlaştırıcı; kullanarak isoflurane (% 1-3) ile ayak-çimdik tarafından anestezi derinliği onaylayın. Hayvan veteriner merhem uygulamak &#39; kurutma önlemek için gözleri.</li>
		<li>Kısaca girdap donör hücreleri (1 s) ve 1 mL enjeksiyon şırınga ile 27 G, iğne, 0.5 differentially etiketli hücre popülasyonlarının, varsa birleştirerek aktarmak.
		<ol><li>Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi Analizi için sabitleştirici çözüm (1 mL) karışık hücrelerinin transfer.</li>
		</ol></li> <li>Yüzükoyun sígara donör hayvanlar koyun. Biraz çıkıntı gözün neden göze dorsal cilt hafif Kaudal basınç uygulamak.</li>
		<li>İğne da doğrudan ve donör hücre süspansiyon, 100 µL retro-orbitally her alıcı fare enjekte. Hücre-de var enjekte kuyruk damar yolu ile.</li>
		<li>Yavaş yavaş enjeksiyon iğne geri çekilin ve fare kurtarma kafeste tek başına yerleştirin. Bilinci yerine geldi kadar hayvan izlemek; bir kez tam olarak kurtarılan dönüş hayvan sosyal konut.</li>
	</ol></li> <li>Toplama ve analiz <ol><li>sonra 1 h, isoflurane anestezi (1-%3) ile alıcı fareler bir Buharlaştırıcı kullanarak anestezi; anestezi derinliği toe-çimdik tarafından onaylamak. Dalak (ya da diğer doku ilgi) hasat (Adım 2.1.2.) her alıcı fare ve komple medya (1 mL/alıcı) yerine. İmzalat hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi. 
		Not: Doku hasat öncesinde daha uzun aralıklarla en az 24 h ile doku birikimi artacak</li>
		<li>Eziyet dalak doku 40 µm naylon mesh ile yavaşça içine bir tek hücre süspansiyon ve transfer için 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak komple medya.</li>
		ACK lizis <li>eklemek 4 hacimleri tampon ve oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya. 1000 x g oda sıcaklığında 2 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Boyama resuspend hücreler arabellek (fosfat tamponlu tuz %1 ile desteklenmiş FBS). Hücreleri saymak ve 3 x 10 7 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için ayarlayın. Bir 96-kuyu alt plaka yuvarlak hücre süspansiyon, 100 µL transfer.</li>
		<li>Leke hücreler için istediğiniz işaretçileri (malzemeleri tablo görmek) göre Akış Sitometresi Analizi için. Fluorophore-Birleşik antikorlar (malzemeleri tablo görmek) karşı istediğiniz işaretleyicileri ekleyin ve 20 dakika içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de kuluçkaya. 100 µL eklemek arabellek boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Pelet 200 µL resuspend tampon boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Resuspend 125 µL boyama içinde Pelet tampon ve Standart prosedürler kullanarak Akış Sitometresi kullanarak örnekleri elde. 
		Not: Yeşil boya 488 nm lazer tarafından heyecan ve emisyon 505 ve 530/30 dikroik filtreleriyle algılanır. Turuncu boya tarafından 561 heyecanlı nm ve emisyon 582/15 dikroik filtre tarafından algılandı.
		<ol><li>Kaydedilmiş hücreleri floresan her boya için telafi etmek için 2.1.8.2 gelen. 
			Not: boncuk tabanlı tazminat eşleme uyarma ve emisyon spectra etiketleme boyalar, fluorophores ile kullanılması olarak suboptimal tazminat sonuçlanır.</li>
			<li>Adım 2.2.2.1 kaydedilen giriş hücrelerden doğru oranını belirlemek için birden fazla etiketli nüfus ( şekil 3) kullanıyorsanız giriş hücresi differentially etiketli kullanın. Etiketlenmemiş hücrelere ( şekil 4) etiketli doku belirli geçiş oranı üzerinde dayalı hesaplamak.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Miktar bağışıklık hücre göç basit kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hızlı içinde in vitro ve in vivodeneyleri. Serum tarafından bir MCP-1 degrade ve büyütme karşısında insan monosit vitro kemotaksisi göstermektedir. Vivo, donör fare splenocytes differentially etiketli ve evlat edinen transferi alıcı hayvanlardan ele geçmiştir.
Bir plaka okuyucu kullanarak birkaç zaman Puan örnekleme avantajı vardır (her 30 olarak sık s) ve g...

Güçlü bağışıklık uygun şekilde karşılık vermek için yaralanma, enfeksiyon ve self-tolerance oluşturmak için hücre tiplerinin sayısız karmaşık zamansal ve mekansal koordinasyon gerektirir. Birkaç düzine Kemokin reseptörleri ve onların karşılık gelen ligandlar keşfettim ve belirli hücreleri tarafından karakterize sağlayan moleküler mekanizmaları belirli bir zamanda belirli bir doku yönlendirilebilir. Böylece, kemotaksis ve geçiş eğitim İmmünoloji araştırma vazgeçilmez bir bileşendir. Nitekim, açıklanan vitro tahlil son zamanlarda T-hücrelerin kemotaksis C-C kemokinler 19. ve 213doğru hızlandırır kemotaktik kofaktör tanımlamak için bir tarama aracı olarak kullanıldı. Yöntem tanımlamak burada amacı olan bağışıklık hücre kemotaksisi vitro ve içinde vivonicel Değerlendirmeler izin vermek için.
Boyden (hücre göç ve işgali) odası tahlil hücre geçiş4,5değerlendirmek için ucuz, tekrarlanabilir ve hızlı bir yöntemdir. Standart tahlil üst odası hücrelerle tohumlari ve içine hücrelerin göç daha düşük bir odası den gözenekli bir ekleme tarafından ayrılmış. İstediğiniz saatte ekleme alt geçiş hücreleri sabit ve Nefelometri için ışık mikroskobu ile lekeli. Ancak, bu tür ölçümleri veri toplama dinamik veri toplama engellemektedir tek bir bitiş noktası için sınırlamak ve geniş en iyi duruma getirme analizi için en uygun zaman noktayı belirlemek için gerektirebilir. Burada, çeşitli uyarlamalar gerçek zamanlı, nicel ve çoğaltılmış ölçümlerinin kemotaksisi vitroizin açıklanmıştır.
Vivo çalışmalar için işlevsel bir bitiş noktası kullanılır, yani belirli birikimi hücre içinde verilen doku bölme. Önceden etiketli donör hücreleri evlat edinen transferi yoluyla alıcı hayvanların içine tanıtıldı. Bu donör hücreleri daha sonra alıcı doku Hasattan sonra Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir. Ayrıca farklı hücre türleri içinde tek bir alıcı hayvan kaçakçılığı belirlenmesi için izin veren co etiketleme bir stratejidir. Bu yöntem hücre enjeksiyon ve fizyolojik arası hayvan değişkenlik hesaplarında arası hayvan varyasyon ortadan kaldırır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Kemotaksis geçiş boyunca belirli bir kimyasal degrade1değil. Kemokinler hücresel anatomik ve temporal özgüllük2ile ticareti teşvik kemotaktik sitokinler vardır. Kemotaksis lenfositler kritik bir fonksiyonudur ve kantitatif olabilir diğer bağışıklık hücreleri içinde vitrodeğerlendirildi. Bu el yazması Kemotaksis, değerlendirilmesi izin yöntemleri açıklar vitro ve in vivo, hücre satırları ve yerel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri için. Vitro, plaka tabanlı biçimi çeşitli koşullar aynı anda içinde karşılaştırma izin verir gerçek zamanlı, 1-4 h. vitro tahlil koşullar olarak tanıtmak agonistleri ve antagonistleri, manipüle içinde tamamlandı ve su kuyusu aynı derecede kemotaksis rasgele hareket olduğu chemokinesis ayırt etmek. Vivo kaçakçılığı değerlendirmeler için bağışıklık hücreleri birden çok floresan boyalar ile etiketli ve evlat edinen transfer için kullanılan. Fark hücrelerinin etiketleme karma hücre popülasyonlarının böylece varyans azaltmak ve hayvanlar için yeterince güçlü bir deney gerekli sayısını azaltarak aynı hayvan içine sunulmasına olanak sağlar. Az 1 h olarak geçiş içine lenfoid doku oluşur ve birden fazla doku bölmeleri tatmak mümkündür. Akış Sitometresi doku hasat takip birden çok hücre tipleri göçmen kalıpları hızlı ve nicel analiz için sağlar.

Calcein-AM boya kullanırken, hücre görsel muayene etiketi alımı (şekil 1) onaylayın. Otomatik floresan okuma zaman içinde ucun alt üzerine hücreleri transit olarak geçiş izler. Bu veriler, serum (şekil 2A) tarafından bir indüksiyon hücre göç MCP-1 doğru hem de bu yanıt bir büyütme açıkça gösteriyor. Göçmen uyarıcı gücüne bağlı olarak, en az 15 dk önce sinyal artışı bir gecikme yoktur. Floresa...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Görüntüleme.  The Rockefeller University. Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

Video: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.