Estamos agradecidos con el Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) para la formación y el plásmido de expresión bacteriana de PrP de cérvidos. SG es apoyado por el programa de la Cátedra de investigación de Canadá. Reconocemos que la financiación para esta investigación a SG de genoma Canadá, Alberta del prión Instituto de investigación y agricultura de Alberta y forestal a través de genoma Alberta y la Universidad de Calgary en apoyo de esta labor. Reconocemos una beca de investigación de la Margaret Gunn Foundation para la investigación Animal.

1. Materia Fecal utilizando RT-QuIC <ol><li>preparación de heces de cérvidos extractos <ol><li>hacer fecal homogeneizado mediante la adición de 1 g de material fecal en 10 mL de heces Extraiga el tampón (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF 1 x completan los inhibidores de proteasa, libre de EDTA) para obtener una concentración final del 10% (p/v). El buffer de homogeneización puede ser preparado antes de la utilización y almacenado a -20 ° C.</li>
		<li>Homogeneizar pellets fecales (1 g) y el tampón (10 mL) en tubos (p. ej., gentleMACS M) utilizando un disociador con un programa preestablecido por el fabricante para las proteínas durante 1 min a temperatura ambiente. Repita este paso dos o tres veces hasta que las muestras fecales son completamente homogeneizadas en el buffer de.</li>
		<li>Sellar los tubos con parafilm y colocar sobre un agitador oscilante plataforma o rotatorio para una incubación de 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 18.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante que contiene la proteína extractos y alícuota en mL 1,5 tubos. Pueden conservarse alícuotas a-80 ° C para otras aplicaciones.</li>
	</ol></li> <li>Concentración de PrP Sc en heces extractos Nota: para concentrar priones CWD en las muestras de extracto de las heces, mejorando la sensibilidad de detección por RT-QuIC, se agrega un paso de precipitación de proteína en el protocolo.
	<ol><li>Método de precipitación de NaPTA</li> <li>Añadir 250 μl de 10% (p/v) de N-lauril sarcosinato (sarkosyl) a 1 mL de proteína fecal extracto para dar una concentración final de sarkosyl de 2% (v/v).</li>
		<li>Sellar los tubos que contienen las muestras con parafilm e incuban a 37 ° C durante 30 min, bajo agitación constante a 1.400 rpm en un Termomezcladores.</li>
		<li>Ajustar la mezcla de extracto de proteína fecal y sarkosyl con una solución que contenga 10% (w/v) de sodio ácido fosfotúngstico y 170 mM de cloruro de magnesio, pH 7,4 para obtener una concentración final de 0.3% (p/v) sodio ácido fosfotúngstico en las muestras de.</li>
		<li>Incubar las muestras a 37 ° C por 2 h con agitación constante a 400 rpm.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 14 ° C por 30 min a 15.800 x g. Quitar cuidadosamente los sobrenadantes.</li>
		<li>Lavar las pelotillas a resuspender en tampón de lavado (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% sodio desoxicolato (w/v) y 0.1% sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 14 ° C por 15 min a 15.800 x g. Quitar cuidadosamente los sobrenadantes.</li>
		<li>Resuspender el pellet en 100 μl (1/10 del volumen original de la proteína fecal extracto) de tampón de dilución de RT-QuIC. 
		Nota: RT-QuIC tampón de dilución (fosfato de sodio 20 mM, pH 6.9, 130 mM de NaCl, 0,1% SDS (p/v) y 1 X N2 suplemento) es preparado antes de la utilización. Un volumen total de 10 mL se filtra a través de un filtro de jeringa acrodisc 0.2 μm utilizando una jeringa y luego almacenado a-20 ° C hasta su uso.</li>
		<li>Tienda las NaPTA tratada las muestras a-20 ° C hasta utilizar en análisis RT-QuIC.</li>
	</ol></li> <li>Ensayo RT-QuIC <ol><li>preparar una solución fresca 10 mM Th-T (0,032 g de Th-T en 10 mL de doble destilada H 2 O).</li>
		<li>Hacer una dilución de 1:10 del Th-t solución stock en doble destilado de H 2 O el filtro a través de una jeringa acrodisc de 0.2 μm filtro utilizando una jeringa para una concentración final de Th-T de 1 mM.</li>
		<li>Descongelar el sustrato PrP (formará, aa 23-231) recombinante mouse (10 μg/mL por reacción RT-QuIC) almacenado a -80 ° C en hielo.</li>
		<li>La carga 500 μl de substrato formará en un momento en filtro de exclusión del tamaño kDa 100 microtubos y centrifugar a 14.000 xg por 5 min a temperatura ambiente (un tubo de filtro puede utilizarse hasta dos veces).</li>
		<li>Transferencia del sustrato eluído en un tubo estéril de 1.5 mL y guardar a 4 ° C hasta su uso.</li>
		<li>Deshielo RT-QuIC tampón de dilución de almacenado a -20 ° C.</li>
		Tampón de dilución de <li>hacer diluciones de la semilla (extracto fecal de proteína) en RT-QuIC: 
		Muestra sin diluir: utilizar el extracto fecal de proteína sin diluir diluido 2 x 10 -1 diluido 2 x 10 -2 diluido 2 x 10 -3</li> <li>Preparar soluciones para la mezcla de reacción RT-QuIC: (solución salina tamponada con fosfato PBS): 5 X NaCl: 2 M stock solución de NaCl preparada en doble destilada H 2 O. 
		100 mM EDTA: solución de EDTA en doble destilado H 2 O.</li>
		<li>Antes de la utilización de las soluciones (paso 1.3.8), filtrar cada solución por separado a través de un filtro de jeringa acrodisc 0.2 μm utilizando una jeringa y mantenerlos estéril a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar un volumen total de mezcla de reacción RT-QuIC según el número de muestras (98 Volumen μl de reacción por muestra y cuatro réplicas por muestra) que se utilizará más el 10% de este volumen para asegurarse de tener suficiente mezcla para todas las reacciones.
		<ol><li>Uso un tubo de 15 mL para preparar la mezcla de reacción RT-QuIC (fosfato de sodio 20 mM, pH 6.9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μm Th-T, sustrato de formará de 10 μg/mL y agua bidestilada para ajustar la concentración final formará en la reacción) mediante la acción sol utions.</li>
			<li>Mezclar las soluciones bien mediante pipeteo arriba y abajo utilizando una pipeta con una punta de filtro. Evitar tanto como sea posible el uso de vórtice de.</li>
			<li>Vierta la mezcla en un depósito de pipetas desechables de 50 mL.</li>
			<li>Utilizar una pipeta multicanal para cargar 98 μl de mezcla de reacción RT-QuIC en cada pocillo de una placa de 96 pocillos óptico inferior.</li>
		</ol></li> <li>Añadir a cada RT-QuIC reacción 2 μl de aceite puro o extracto de la proteína fecal en serie diluida 10 veces. Cada muestra de prueba en cuatro repeticiones. 
		Nota: En cada experimento, diluciones seriadas de muestras fecales (desde sin diluir hasta 2 x 10 -3) de CWD-negativo y verificado de CWD-positivo de animales se utilizan como controles positivos y negativos, respectivamente.</li>
		<li>Sellar la placa con una cinta de sellado antes de la incubación en un lector de placas a 42 ° C para 25 h con ciclos repetidos de 1 min doble orbital sacudir (700 rpm) y a 1 minuto de descanso a lo largo de la incubación.</li>
		<li>Definir configuración de medidas de fluorescencia: 
		Excitación: 450 nm emisión: 480 nm fondo leer, número de destellos: 20 ganancia Manual: 1000 (depende de la máquina) tiempo de integración: 20 μs</li> <li>Quite la placa del lector de la placa en el extremo de la h. 25</li>
		<li>Girar hacia abajo la placa a 3.000 x g durante 3 min evitar la posible contaminación entre los pozos de.</li>
		<li>Retire el sello de la placa de.</li>
		<li>Preparar una nueva placa de 96 pocillos, agregar 90 μl de mezcla de reacción RT-QuIC que contiene sustrato fresco y fresco de la fluorescencia del tinte Th-T como se describe en la sección 1.3.1 a 1.3.6.</li>
		<li>Transferir 10 μl de cada pocillo de la primera placa a 96 recién preparado de la placa bien.</li>
		<li>Sellar la placa de nuevo y continuar el ensayo RT-QuIC h 50 adicionales siguiendo los pasos descritos en el paso 1.3.13. Este paso adicional de 50 h hará que el tiempo de reacción total de 75 h. 
		Nota: Todos los procedimientos de ensayo de RT-QuIC se hacen bajo gabinete de bioseguridad.</li>
		<li>Recopilar los datos.
		<ol><li>Lectura y documento de la señal de fluorescencia Th-T de cada pozo cada 15 min.</li>
			<li>Recopilar datos de ciclos total con software de análisis de datos y transferencia a una hoja de cálculo, el promedio de reacciones cuatriplicados.</li>
			<li>Parcela los promedios de los datos. El eje x corresponde a la época de la reacción de RT-QuIC (h) y el eje y corresponde a las unidades de fluorescencia relativa (RFU). Cada curva corresponde a una dilución de una muestra conocida.</li>
			<li>En cada experimento, demarcar un umbral mediante el cálculo de los valores más altos de la media del control negativo más 5 desviaciones estándar como se describe en corriente publicó literatura 41. 
			NOTA: Todas las repeticiones que cruzó el umbral definido son consideradas positivas. Si por lo menos dos de cuatro repeticiones cruzar el umbral, la muestra entonces se considera positiva.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Purificación de la proteína de prión recombinante (formará) <ol><li>crecimiento de la población bacteriana y la expresión de formará Nota: la Escherichia coli (e. coli) cepa Rosetta (DE3) transformada con el vector pET-24 codificación la ratón PrP (residuos 23-231) se utiliza para preparar lo formará.
	<ol><li>Deshielo stock de glicerol de Rosetta (DE3) transformada con pEt-24 mPrP(23-231) en hielo.</li>
		<li>Raya LB (Luria Bertani) placas con una concentración final de 50 μg/mL de kanamicina e incubar durante una noche en una incubadora de 37 ° C. Asegúrese de que las placas estén boca abajo evitar la condensación de humedad en el medio sólido que contiene las bacterias. Preparar dos placas para asegurarse de que tienen un crecimiento de al menos una de las dos placas de.</li>
		<li>Preparar 1 L de LB y autoclave para hacer estéril.</li>
		<li>Suplemento 1 L de medio LB estéril con 1 mL de kanamicina (50 mg/mL) y 1 mL de cloranfenicol (34 mg/mL).</li>
		<li>Elegir una colonia de cada placa mediante el uso de un asa de inoculación desechables para inocular 3 mL de medio LB con kanamicina y cloranfenicol.</li>
		<li>Lugar las culturas de mini en una incubadora a 37 ° C con agitación constante a 225 rpm durante 5-6 h.</li>
		<li>Añadir las culturas mini al resto de la original 1 l de medio LB junto con Express autoinducción sistema 1 para la inducción de expresión de la proteína.</li>
		<li>Lugar de la cultura en matraz de 2 L, o más grande, en una incubadora a 37 ° C con agitación constante a 200 rpm durante 20-24 h.</li>
		<li>Divide la cultura 1 L en tubos de centrífuga de 4 x 250 mL.</li>
		<li>Girar por los tubos que contienen la cultura a 3.750 x g por 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante y recoger los pellets bacterianos en tubos de centrífuga de 50 mL, luego congelarlas a-80 ° C hasta el procesamiento posterior. Los pellets resultantes han pesado 3 a 4 g para un rendimiento de proteína buena.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de cuerpo de inclusión <ol><li>descongelar los pellets congelados (3 a 4 g) a 37 ° C durante pocos minutos.</li>
		<li>Congelar el sedimento una vez más por 10 min a-80 ° C y descongelar otra vez. Repita este paso de congelación y descongelación dos veces más.</li>
		<li>Resuspender el precipitado bacteriano de 1 X reactivo de lisis (e.g. BugBuster Master Mix) transfiriendo bien. Usar 5 mL del reactivo de 1 g de pellet bacteriano. Asegúrese de homogeneizar completamente la mezcla de.</li>
		<li>Incubar el homogeneizado en un eje de balancín por 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar el homogeneizado a 16.000 x g por 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Descartar los sobrenadantes por cuidadosamente verter apagado</li>
		<li>Homogeneizar las pelotillas en el mismo volumen de 1 X reactivo de lisis en el paso anterior.</li>
		<li>Incubar el homogeneizado por 15 min en un eje de balancín a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir un volumen suficiente de 1:10 (0.1 x) reactivo de lisis para obtener un volumen total de homogeneizado de 40 mL. Mezcla por inversión para asegurarse de que homogeneizar bien.</li>
		<li>Centrifugar el homogeneizado a 7.900 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante, vertiendo cuidadosamente lo</li>
		<li>Resuspender el pellet en 40 mL de 0.1 x reactivo de lisis.</li>
		<li>Centrifugar el homogeneizado a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descartar el sobrenadante cuidadosamente por verterlo y almacenar el pellet que contiene los cuerpos de inclusión a-20 ° C hasta el procesamiento más.</li>
	</ol></li> <li>Purificación de proteínas <ol><li>descongelar los cuerpos de inclusión a temperatura ambiente.</li>
		<li>Disolver los cuerpos de inclusión descongelados en 14 mL de 8 M guanidina-HCl (clorhidrato de la guanidina 38 g en 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 y llenar la suspensión con H 2 O a 50 mL; no ajustar el pH en la solución final) para solubilizar proteínas de.</li>
		<li>No se olvide de homogeneizar bien transfiriendo hacia arriba y hacia abajo.</li>
		<li>Incubar el lisado en un eje de balancín a temperatura ambiente durante 50 min.</li>
		<li>Preparar 18 g de resina de Ni-NTA (18 g para pellet bacteriano 3 a 4 g) de granos, enjuagar con 100 mL de agua utilizando vacío y un filtro superior botella de 100 mL 0,22 μm.
		<ol><li>18 g de granos de la resina de Ni-NTA en tubo de 50 mL y añadir un volumen suficiente de desnaturalización buffer (100 mM fosfato de sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, el clorhidrato de guanidina de 6 M, pH 8) para el volumen final hasta 50 mL.</li>
			<li>Equilibrar las cuentas en el búfer de desnaturalización durante 50 minutos en un eje de balancín a temperatura ambiente.</li>
		</ol></li> <li>El cuerpo de inclusión lisado a 16.000 x g durante 5 min eliminar los desechos insolubles de centrífuga.</li>
		<li>Añadir el sobrenadante a las cuentas equilibradas y deseche los pellets.</li>
		<li>Poner la mezcla en un eje de balancín de 40 min a temperatura ambiente para permitir la Unión a proteínas a resina de Ni-NTA. 
		Nota: Cuentas quelato de níquel se utilizan para purificar el PrP por su afinidad de níquel. La región del N-terminal rica en histidina de PrP representa la afinidad de níquel (II), que permite que la proteína a se unen a los iones sin cualquier su-etiqueta de níquel.</li>
		<li>FPLC de lavado con agua para limpiar ambas líneas (A y B).</li>
		<li>Ejecutar desnaturalización buffer (100 mM fosfato de sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, el clorhidrato de guanidina de 6 M, pH 8) a través de dos líneas (A y B) para cebar el sistema (no se adjunta la columna).</li>
		<li>Cargar la resina en la columna. Asegúrese de minimizar las burbujas de aire.</li>
		<li>Coloque la columna en el FPLC y ejecute un degradado lineal desde 100% buffer A la desnaturalización y 0% de repliegue tampón B (fosfato de sodio 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) en primera desnaturalización buffer de 0% y 100% refolding búfer al final. Este cambio gradual se ejecuta con un caudal de 0,75 mL/min durante 240 min y es necesario para el correcto plegamiento de PrP. 
		Nota: Durante el proceso de purificación cromatográfica, el PrP desnaturalizado es primero lentamente replegado en la resina mediante la aplicación de un degradado lineal de repliegue tampón para reemplazar el búfer de desnaturalización. Este paso también elimina la caotrópico guanidina-HCl.</li>
		<li>Asegúrese de que buffer repliegue 100% continúa fluyendo a través de la columna por un adicional 30 min a 0,75 mL/min.</li>
		<li>Enjuague línea con agua seguido de tampón de elución (fosfato del sodio de 100 mM, 10 mM Tris, imidazol de 500 mM, pH 5.8) pasando por alto la columna. Esto limpiará hacia fuera el búfer de desnaturalización que ha sido sustituido ahora por el tampón de elución en el sistema AKTA.</li>
		<li>Elute proteína a 2 mL/min mediante la ejecución de un degradado lineal para 40 minutos 100% refolding de tampón B y tampón de elución de 0% al principio a 0% refolding tampón y tampón de elución de 100%. 
		Nota: La alta concentración de imidazol en tampón de elución competirán PrP &#39; Unión de s al níquel (II). El pico de primaria debe comenzar a fin de eluir aproximadamente 1/3 a través de la gradiente.
		<ol><li>Ver cromatograma para OD 280 nm aumentar.</li>
		</ol></li> <li>Recoger sólo los tubos que contienen la proteína en el centro de la cima grande. 
		Nota: Se recogen las fracciones eluídas de 2 mL en tubos de 15 mL.</li>
		<li>Diluir la proteína contenida en los tubos inmediatamente con 1/3 volumen (1 mL) de tampón de diálisis (fosfato de sodio 10 mM, pH 5.8).</li>
		<li>Inmediatamente Coloque los tubos en hielo.</li>
		<li>La proteína eluída contenida en los tubos de la piscina.</li>
		<li>Pobre la proteína en Cassettes de diálisis (peso molecular de corte 10 kDa).</li>
		<li>Poner los cassettes en buffer de diálisis previamente enfriada (3,6 L) por 2 h a 4 ° C, luego transfiera los casetes en un buffer de diálisis fresca (3,6 L) para pasar la noche. Hacer seguro que es el buffer de diálisis bajo agitación constante.</li>
		<li>Filtro de proteína después de diálisis a través de un filtro de jeringa acrodisc 0.2 μm utilizando una jeringa de.</li>
		<li>Medir la concentración de proteína usando un kit de análisis de proteína BCA.</li>
		<li>Concentrado o diluir si es necesario ajustar la concentración de proteína a 0,3 mg/mL. 
		Nota: Confirmar pureza por SDS-PAGE y el azul de Coomassie tinción.</li>
		<li>Hacer alícuotas de 1 mL de proteína en tubos de microcentrífuga y almacenar inmediatamente a-80 ° C hasta su uso posterior como se describe en el protocolo de RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

RT-QuIC fue empleada previamente para detectar priones CWD en orina y fecales extractos de venado cola blanca y venado bura oral infectada 38. El sistema que se muestra en este manuscrito es un método adaptado del ensayo RT-QuIC. Pasos adicionales se incorporaron en el ensayo de RT-QuIC "clásico" para mejorar la detección y la sensibilidad del ensayo de priones CWD en materia fecal de animales infectados.
La baja sensibilidad de la detección en extractos de las hece...

Enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Creutzfeldt - Jakob (ECJ) en humanos, la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en bovinos, scrapie en ovejas y cabras y emaciación crónica enfermedad (CWD) en cérvidos 1,2. Las EET se caracterizan por la apariencia espongiforme distintivo y pérdida de neuronas en el cerebro. Según la hipótesis de "sólo proteína", priones están compuestos principalmente de PrPSc ('Sc' para scrapie) 3, una isoforma mal plegada de la proteína priónica celular codificada en host, PrPC. PrPSc resulta de la transformación de PrPC en una conformación enriquecida en hojas de ᵦ 4,5,6 que puede actuar como una semilla para enlazar y convertir otras moléculas de PrPC . Las moléculas de PrPSc recién generadas se incorporan en un crecimiento polímero 7,8 se rompe en pequeños oligómeros, dando por resultado un número mayor de núcleos infecciosos. PrPSc es propensa a la agregación y es parcialmente resistente a proteasas 9,10.
CWD afecta salvajes y cultivados elk (Cervus canadensis), venado bura (Odocoileus hemionus), venado de cola blanca (DMT; Odocoileus virginianus), alces (Alces alces) y renos (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Se considera la enfermedad más contagiosa del prión con transmisión horizontal favorecida por las interacciones de cérvidos y persistencia ambiental de infectividad 14,15. A diferencia de otras enfermedades priónicas en acumulación de PrPSc e infectividad se limitan al cerebro, en CWD estos también se encuentran en tejidos periféricos y fluidos corporales por ejemplo, saliva, orina y heces 16,17, 18.
Inmunohistoquímica se considera el estándar de oro para el diagnóstico CWD detectar PrPSc distribución y espongiforme lesiones 19,20. ELISA y en más raras ocasiones, mancha blanca /negra occidental también se utilizan para el diagnóstico CWD. Así, diagnóstico de enfermedades priónicas actual se basa principalmente en la detección de priones en tejidos post-mortem. El diagnóstico ante mortem para CWD está disponible tomando las amígdalas o biopsias de tejido linfoide asociado a mucosa recto-anal (RAMALT); sin embargo, este procedimiento es invasivo y requiere la captura de los animales. Así, el uso de muestras de fácil acceso, como la orina y las heces, sería una manera práctica para la detección de priones CWD. Sin embargo, esos puerto de excretas relativamente bajas concentraciones de priones por debajo del límite de detección actuales de métodos de diagnóstico. Por lo tanto, es necesaria una más sensible y de alto rendimiento herramienta de diagnóstico. In vitro sistemas de conversión, tales como proteína mal plegamiento de amplificación cíclica del análisis (EPCP) 21, amiloide siembra ensayo y conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC) ensayo 22,23, 24 son herramientas muy poderosas para explotar la capacidad uno mismo-propagación de PrPSc para imitar en vitro el proceso de conversión del prión y así ampliar la presencia de cantidades minuciosas de PrPSc a niveles detectables 25 ,26. El método de RT-QuIC, sin embargo, aprovecha el hecho de que el producto de conversión enriquecido en β-hoja estructura secundaria puede atar específicamente tioflavina T (Th-T). Por lo tanto, PrP recombinante (formará) sobre conversión de semilla crece en las fibrillas amiloideas que Th-T se unen y así se pueden detectar en tiempo real midiendo la fluorescencia del Th-T expresada en unidades de fluorescencia relativa (RFU) con el tiempo. Una vez controlados, la RFU puede utilizarse para evaluar actividades siembra relativa y parámetros cuantitativos como la fase lag. La fase de retraso representa el tiempo (h) necesario para alcanzar el umbral, durante que formará la conversión en la etapa temprana de la reacción es por debajo del límite de detección de fluorescencia Th-T. Al final de la fase de retraso evidente, concomitante a la formación de un núcleo de amiloide suficiente (carga/alargamiento), ocurre cuando la fluorescencia Th-T supera el nivel umbral y se convierte en positivo. El crecimiento de amiloide fibrillas se pueden detectar en tiempo real y la inicial de PrPSc o siembra actividad contenida en la muestra es amplificado por la segmentación que genera más semillas. Estas semillas a su vez inducen una rápida fase exponencial de crecimiento de la fibra amiloide.
Debido a que este análisis sean capaz de detectar tan bajo como 1 fg de PrPSc 24, la alta sensibilidad califica esta técnica para lograr ante mortem o diagnóstico no invasivo mediante la detección de PrPSc en diversos tejidos periféricos, excretas u otros tipo de muestra que los bajos niveles de infectividad. RT-QuIC definitivamente proporciona ventajas sobre otros ensayos para su reproducibilidad, practicidad, rapidez (menos de 50 h) y bajos costos en comparación a las pruebas biológicas. Evita las complejidades técnicas como sonicación en EPCP; también, se realiza en una microplaca de cinta de sellado que minimiza el riesgo de contaminación de aerosoles de cada pozo. El formato multi-bien permite el análisis de hasta 96 muestras en el mismo experimento. Para contrarrestar el problema recurrente de los falsos positivos y la conversión espontánea de formará en los ensayos de conversión en vitro es muy útil la aplicación de un umbral (corte) en RT-QuIC. De hecho, basándose en los resultados del control negativo (RFU promedio de muestras negativas + 5 SD 27), una línea de base se establece que se puede hacer discriminación entre muestras positivas y negativas. El uso de cuatro repeticiones para cada muestra así puede ayudar a definir una muestra como positiva cuando al menos el 50% de las repeticiones muestran una señal positiva, es decir, cruzar el corte 28. La homología entre la semilla y el substrato no es necesaria en RT-QuIC, como por ejemplo en un estudio anterior, formará hámster fue encontrado ser un sustrato más sensible en comparación con el sustrato homólogo en humanos de PrPECJv sin semillas y scrapie ovino sembrado reacciones 29. oveja hámster quimérica formará también sugirió que un sustrato más adecuado que formará humana para la detección de priones ECJ variante humana 30. Por lo tanto, la utilización de sustratos formará de distintas especies es muy común en este ensayo. Este ensayo se ha aplicado con éxito a varias enfermedades del prión como la esporádica CJD 31,32,33, genenfermedades de prion ETIC 34, EEB 35,36,37, tembladera 23,36y CWD 38,39,40,41, 42. Estudios usando procesan líquido cefalorraquídeo, sangre, saliva y orina como semillas en RT-QuIC todos lograron detectar PrPSc 38,39,40,41, 42. fomentar la capacidad de detección en muestras de plasma de la sangre que puede contener inhibidores de la formación de amiloide, Orrú et al. (2011) desarrolló una estrategia para eliminar potenciales inhibidores de la formación amiloide peinando PrPSc paso de inmunoprecipitación (IP) y RT-QuIC, llamado "mejorado QuIC" ensayo (eQuIC). Además, un paso de recambio de sustrato se empleó después de ~ 24 h de tiempo de reacción para mejorar la sensibilidad. En última instancia, como solo 1 ag de PrPSc era perceptible por el eQuIC 30.
Con el fin de purificar extractos de las heces y eliminar inhibidores de posible análisis en heces, muestras de heces recogidas en las fases preclínicas y clínicas de alce sobre infección oral experimental se homogeneizaron en tampón que contiene detergentes e inhibidores de la proteasa. Los extractos de las heces más fueron sometidos a diferentes metodologías para PrPSc se concentran en las muestras utilizando la precipitación de la proteína en el ácido (NaPTA) precipitación de sodio fosfotúngstico. El método de precipitación de NaPTA, primero descrito por Safar et al. 43, se usa para PrPSc se concentran en las muestras de prueba. La incubación de NaPTA con la muestra de resultados en la precipitación preferencial de PrPSc en lugar de PrPC. Sin embargo, el mecanismo molecular es todavía incierto. Este paso también ayudó a contener y prevenir la conversión espontánea de formará, que se observa en algunos casos. Finalmente, los extractos de las heces se analizaron optimizado RT-QuIC usando ratón formará (aa 23-231) como sustrato y como recambio de sustrato en el protocolo para mejorar la sensibilidad de detección.
Los resultados aquí demuestran que este método mejorado puede detectar muy bajas concentraciones de priones CWD y aumenta la sensibilidad de detección y especificidad en muestras fecales en comparación con un protocolo sin reemplazo de precipitación y el substrato de NaPTA. Potencialmente, este método puede ser aplicado a otros tejidos y fluidos corporales y puede ser de gran utilidad para la vigilancia de CWD en cérvidos silvestres y en cautiverio.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc seringe filters</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tapes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial buffers and solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Standards and commercial kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein purification systems FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sofware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

La técnica de RT-QuIC es una sensibilidad en vitro acelulares priones test de amplificación basado principalmente en el mal plegamiento y agregación de substrato de la proteína (PrP) de prión recombinante usando las semillas del prión como plantilla para la conversión. RT-QuIC es una técnica novedosa de alto rendimiento que es análoga a la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR). Detección de crecimiento de fibrilas amiloides se basa en el colorante tioflavina T, que aparece sobre la interacción específica con proteínas ricas hoja de ᵦ. Así, la formación de amiloide puede detectarse en tiempo real. Hemos intentado desarrollar una prueba de cribado no invasiva confiable para detectar priones de la enfermedad (CWD) emaciación crónica en extracto fecal. Aquí, específicamente hemos adaptado la técnica de RT-QuIC para revelar PrPSc siembra actividad en heces de CWD infectados cérvidos. Inicialmente, la actividad de siembra de los extractos fecales preparamos fue relativamente baja en RT-QuIC, posiblemente debido a potenciales inhibidores de análisis en la materia fecal. Para mejorar la actividad de siembra de los extractos de las heces y eliminar potenciales inhibidores de ensayo, homogeneizaron las muestras fecales en un tampón que contiene detergentes e inhibidores de la proteasa. También hemos presentado las muestras a diferentes metodologías para concentrarse PrPSc en base a la precipitación de la proteína usando sodio ácido fosfotúngstico y la fuerza centrífuga. Finalmente, los extractos de las heces se analizaron optimizado RT-QuIC que incluyó el recambio de sustrato en el protocolo para mejorar la sensibilidad de detección. Así, estableció un protocolo para la detección sensible de priones CWD siembra actividad en heces de cérvidos preclínicos y clínicos por RT-QuIC, que puede ser una herramienta práctica para diagnóstico no invasivo de CWD.

Los extractos fecales CWD preparados al 10% (p/v) fueron capaces de reacción RT-QuIC de la semilla, sin embargo, la sensibilidad de detección fue de baja 27. Utiliza un búfer específico de homogeneización fecal fue un paso crítico para evitar la fluorescencia del fondo alto en reacciones de RT-QuIC concomitantes al uso de sustrato de ratón formará más que formará de ciervos que permitió obtener más resultados de 27. La adición d...

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica de amplificación del prión simple, rápido y eficiente, el método de conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC).

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K vistas.  University of Calgary. Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica de amplificación del prión simple, rápido y eficiente, el método de conversión inducida por el temblor en tiempo real (RT-QuIC).

Video: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Investigación

Inmunología e Infección

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicina

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major zoonotic risk. Here, our objective was to utilize a laboratory protocol to determine the relative copy number of the rabies virus (RABV) genome in different bovine brain anatomical structures using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR quantifies the specific number of gene copies present in a sample based on fluorescence emitted after amplification that is directly proportional to the amount of target nucleic acid present in the sample. This method is advantageous owing to its short duration, reduced risk of contamination, and potential to detect viral nucleic acids in different samples more easily compared to other techniques. The brains of six rabid animals were divided into six anatomical structures, namely the Ammon&#8217;s horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, and thalamus. All brains were identified as positive for RABV antigens based on a direct immunofluorescence test. The same anatomical structures from the brains of four RABV-negative bovines were also assessed. RNA was extracted from each structure and used for qRT-PCR. An assay was performed to determine the copy numbers of RABV genes using an in vitro transcribed nucleoprotein gene. The standard curve used to quantify viral RNA exhibited an efficiency of 100% and linearity of 0.99. Analysis revealed that the cortex, medulla, and thalamus were the ideal CNS portions for use in RABV detection, based on the observation that these structures possessed the highest levels of RABV. The test specificity was 100%. All samples were positive, no false positives were detected. This method can be used to detect RABV in samples that contain low levels of RABV during diagnosis of BPR.

This protocol presents a qRT-PCR-based approach for determining the rabies virus nucleoprotein (N) gene copy number within various bovine brain anatomical structures using in vitro transcription.

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Prueba de deslizamiento de laboratorio de seguridad priónica

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Neurociencias

Detecting Abnormal Prion Proteins in Brain Tissue Using Immunohistochemistry

Source: Orge, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64560">Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates a technique to detect misfolded prion protein in brain sections using immunohistochemistry. Upon treating the brain section with formic acid to denature prions and minimize infection risk, as well as unmasking the prion aggregates using heat-induced epitope retrieval, the sections are immunolabeled for the misfolded prion protein aggregates and observed under a microscope.

Detección de proteínas priónicas anormales en el tejido cerebral mediante inmunohistoquímica

1. Tissue sectioning and slide preparation

	Cut sections of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues at 3-5 &#181;m thickness using a microtome.
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

Take tissue homogenate from a mammalian brain that contains both normal prion proteins and misfolded prion aggregates responsible for neurodegenerative diseases.
Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.
Treat the aggregates with a denaturing buffer at a high temperature to linearize the proteins and impart a uniform negative charge.
Load the sample onto an electrophoresis gel and separate the proteins into bands, which confirms the presence of aggregates.
Using an electric field, transfer the separated proteins onto a membrane.
Incubate the membrane in a blocking solution to mask non-specific binding sites.
Incubate with peroxidase enzyme-tagged antibodies, which bind specifically to the prion aggregates.
Wash the membrane to remove unbound antibodies, minimizing non-specific signals.
Add a chemiluminescent substrate and an oxidizing agent, enabling the peroxidase to oxidize the substrate and produce light.
Measure the light intensity to quantify misfolded prions in the homogenate.

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Resumen

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