Nuestro grupo multidisciplinario está tratando de entender cómo una proteína infecciosa, un prión, puede realizar tareas biológicas complejas. También estamos interesados en cómo los priones pueden persistir en el medio ambiente durante años o décadas. Después de los procedimientos de descontaminación de priones, no se disponía de un método sólido para determinar la eficacia de la inactivación de priones.
Estamos tratando de abordar este problema con nuestra investigación. El método de hisopado, junto con RT-QuIC, permite muestrear una amplia gama de superficies para detectar actividades de siembra de priones. Esto se puede utilizar para detectar priones asociados a la superficie en entornos de laboratorio, clínicos o ambientales.
Estoy interesado en comprender cómo interactúan los priones con las superficies y los requisitos de los priones unidos a la superficie para establecer la infección. Para comenzar, identifique y etiquete las áreas de vigilancia apropiadas para la toma de muestras. Prepare dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada área identificada y agregue 250 microlitros de DPBS al primer tubo, dejando vacío el segundo.
Recupere los hisopos con punta de espuma del almacenamiento en un área libre de contaminación priónica. Prepare los controles positivos y negativos utilizando homogeneizados cerebrales apropiados o BH en DPBS. Con guantes limpios, saque la cantidad requerida de hisopos de espuma del empaque y colóquelos con el mango hacia abajo en una rejilla para tubos.
Asegurarse de que las puntas no entren en contacto con otras superficies. Sosteniendo un hisopo de espuma limpio por el mango, aplique 50 microlitros de las respectivas muestras de control positivo y negativo a las puntas del hisopo. Con unas tijeras, corte el exceso de mango del hisopo hasta aproximadamente la mitad de su longitud y coloque el hisopo en el tubo de microcentrífuga precargado para sumergir la punta de espuma en DPBS.
Sosteniendo un hisopo limpio con punta de espuma por el mango, humedezca previamente la punta de espuma con agua de grado molecular y sacuda el exceso de agua. Coloque la punta de espuma humedecida en el área elegida para la vigilancia y frote el área hacia adelante y hacia atrás aproximadamente 10 veces mientras gira simultáneamente la punta del hisopo sobre la superficie. Con unas tijeras, corte el exceso de mango del hisopo hasta aproximadamente la mitad de su longitud y coloque el hisopo en el tubo de microcentrífuga precargado para sumergir la punta de espuma en DPBS, asegurándose de que la tapa pueda cerrarse por completo.
Deseche los guantes y reemplácelos por otros nuevos antes de pasar al siguiente sitio de hisopado para minimizar la contaminación cruzada. Para la extracción del hisopo, coloque el tubo de microcentrífuga en una rejilla de tubos circular y sumerja la rejilla en el baño de agua del sonicatéter de bocina de taza. Asegúrese de que el hisopo de espuma en DPBS dentro del tubo esté debajo de la superficie del agua, dejando las partes del mango sin sumergir.
Sonicar la muestra durante 15 segundos en total, con ciclos de cinco segundos encendidos y cinco segundos apagados. Tras la sonicación, centrifugar el tubo durante aproximadamente 15 segundos para recoger el DPBS en el fondo del tubo antes de la transferencia. Con una pipeta P 1000 configurada a 250 microlitros, recoja cuidadosamente todo el extracto líquido del hisopo del fondo en el tubo vacío preetiquetado correspondiente.
Deseche el tubo usado que contiene el hisopo. Concentre la muestra en un concentrador de vacío, asegurándose de que la tapa del tubo esté abierta, al finalizar el ciclo, asegúrese de que la muestra esté completamente concentrada y solo quede un gránulo. Guarde el pellet a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior.
Para el análisis de RT-QuIC, prepare una placa de control negativa y positiva con los correspondientes homogeneizados cerebrales diluidos en una solución de dilución tisular. Ahora descongele el pellet de extracto de hisopo almacenado del congelador a menos 80 grados centígrados y vuelva a suspender el extracto de hisopo seco con 50 microlitros de agua de grado molecular mediante pipeteo. Agite brevemente el vórtice y deje reposar la muestra a temperatura ambiente.
Cargue dos microlitros de controles de placa negativa y positiva, seguidos de extracciones de hisopo, en los respectivos pocillos de placa RT-QuIC. Los hisopos de control negativo no cruzaron el umbral de fluorescencia positiva, lo que confirma que no hubo contaminación durante los procedimientos. Los extractos de hisopos de control positivo exhibieron una siembra consistente en todos los pozos replicados, lo que demuestra una sensibilidad de detección adecuada.
Las muestras de hisopos de superficie de áreas no contaminadas no mostraron siembra por encima del umbral, lo que confirma la negatividad de los priones. Las superficies contaminadas con priones exhibieron siembra por encima del umbral con relaciones de puntos máximos y tiempos de fluorescencia variados en comparación con los controles. Las superficies contaminadas con priones tratadas con lejía no lograron sembrar RT-QuIC, lo que demuestra una desinfección efectiva.
Algunos artefactos de superficie exhibieron curvas cinéticas alteradas y tiempos de fluorescencia más largos, lo que indica posibles falsos positivos, probablemente debido a la presencia de polvo o productos químicos residuales en una superficie.
