La técnica permite el diagnóstico confirmatorio de enfermedades priónicas mediante la técnica de tembladera PrP en tejidos, analizando los tipos de tembladera PrP y su distribución para evaluar la desviación punitiva al perfil conocido de deposición de tembladera PrP. La técnica está estandarizada y utiliza anticuerpos específicos contra la tembladera PrP, lo que permite la visualización de la deposición de tembladera PrP en los tejidos. La técnica también proporciona información sobre el área neuroanatómica y el tipo de células.
Comience colocando los portaobjetos con las secciones de tejido en una canasta de tinción de acero inoxidable. Emerge la cesta en un baño de xileno. Después de tres minutos, retire y sumerja la cesta una vez más.
Para eliminar el xileno y rehidratar las secciones, sumerja la cesta en un baño de etanol absoluto. Después de tres minutos, retire y sumerja la cesta una vez más. Seque al aire las secciones antes de colocarlas en un baño de etanol al 90% durante un minuto.
A continuación, transfiera la sección a un baño de etanol al 70% durante otro minuto. Para cada tratamiento de baño de etanol, agite suavemente la cesta deslizante dos veces y drene la canasta antes de la próxima transferencia. Transfiera la canasta a un baño de etanol al 50% durante un minuto.
Sumerja cuidadosamente las secciones de tejido en ácido fórmico al 98% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague las secciones con agua del grifo durante cinco minutos, seguido de enjuagar dos veces con agua destilada. Use un recipiente de tinción de acero inoxidable en la cámara de presión llena con 500 mililitros de agua destilada para pretratar el tampón de citrato de 10 milimolares a 98 grados centígrados durante 20 minutos.
Para fines de control de calidad, coloque una sección de cinta indicadora de autoclave adhesiva en la cesta para controlar la temperatura y la presión. Una vez que la alarma indique que el equipo ha alcanzado el tiempo y la temperatura del programa, sumerja la cesta con portaobjetos. A continuación, inicie el programa en la cámara de presión hasta el punto de ajuste 2 y registre la presión inicial y final de este programa.
Para la inactivación de la peroxidasa endógena, sumerja la cesta de portaobjetos que contiene las secciones de muestra en un baño de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 30 minutos. Cierre las secciones bajo agua corriente durante cinco minutos Después de drenar, sumerja las secciones en solución salina tamponada con Tris durante cinco minutos adicionales. Para la inmunodetección, coloque cada portaobjetos sobre un soporte de placa de cubierta disponible comercialmente prehumedecido con solución salina tamponada con Tris con el lado del tejido orientado hacia el soporte y los bordes de la diapositiva coincidiendo con los dos puntos inferiores del soporte.
Asegúrese de evitar las burbujas de aire. Sostenga el conjunto del portaportaobjetos entre el pulgar y el índice. Mantenga un dedo encima del portaobjetos de muestra y el otro en la parte inferior del soporte, luego coloque el ensamblaje en la galería del sistema.
Para asegurarse de que el conjunto esté bien ensamblado, llene el pozo entre el portaobjetos de muestra y el soporte con solución salina tamponada con Tris sin desbordarla. A partir de este punto, asegúrese de que se deben retener aproximadamente 80 microlitros de solución salina tamponada con Tris entre el soporte y el portaobjetos. No permita que las secciones se sequen.
Disminuya la tinción de fondo antes del tratamiento con el anticuerpo primario incubando previamente las muestras de portaobjetos durante 30 minutos con suero normal al 20% de la misma especie que el huésped de anticuerpos secundario en solución salina tamponada con Tris. Sin lavar las secciones, aplique 200 microlitros de la solución de anticuerpos primarios directamente en cada pocillo del juego portaportaobjetos e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Para lavar las secciones, llene los pocillos con solución salina tamponada con Tris y espere cinco minutos.
Repita el lavado dos veces. A continuación, diluya el anticuerpo secundario biotinilado a una concentración de 1 a 200 en solución salina tamponada con Tris con suero de caballo al 10%. Reparar el volumen requerido en función del número de secciones a tratar.
Aplique 200 microlitros de solución de anticuerpos secundarios en cada pocillo del juego portaportaobjetos. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, repita el lavado salino tamponado con Tris. Para la incubación con peroxidasa del complejo avidina-biotina, prepare el reactivo 30 minutos antes de su uso y aplique 200 microlitros de la solución en cada pocillo del soporte de la placa portaobjetos.
Una vez hecho esto, incubar el soporte de la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se determinó el nivel de inmunomarcaje no específico en animales control con encefalopatías espongiformes transmisibles conocidas negativas para interpretar adecuadamente el inmunomarcaje específico de proteínas priónicas anormales. Se observó que el marcado no objetivo por anticuerpos anti-PrP se producía como tinción intraneuronal discreta de partículas finas, hilos lineales finos irregulares de tinción en el neuropilo, marcado difuso no particulado en algunas áreas de materia gris y blanca, y marcado citoplasmático difuso de neuronas.
La tabla resume la descripción de los tipos de proteínas priónicas anormales inmunomarcadas observadas en la encefalopatía espongiforme bovina, la tembladera clásica y atípica, y una enfermedad de desgaste crónico de los cérvidos para un diagnóstico positivo y criterios establecidos para resultados negativos, no concluyentes e inadecuados. Todos los pasos son muy importantes. El pH de las soluciones y la temperatura ambiente son características importantes para el éxito de esta técnica.
El desarrollo de inmunohistoquímica para detectar tanto la tembladera de PrP como el tipo de células puede proporcionar información sobre cada célula involucrada en la patogénesis principal.
