Este projecto foi financiado pelo National Institutes of Health, sob GM018568. Este protocolo foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é parte da Universidade de Harvard. Muitos agradecimentos são devidos a Thomas Norman e Nathan Senhor por seu trabalho em conceber e fabricar o modelo mestre, usado para os dispositivos mostrados aqui e na construção da versão original do aparelho. Também agradecemos a Johan Paulsson por sua valiosa colaboração assessoria e agradecer aos membros de seu laboratório para seus conselhos e melhorias contínuas para aparelhos microfluidic bacteriana.

1. PDMS dispositivo Casting
<ol><li>Em um ambiente livre de poeira, mistura de polímero PDMS e agente de cura, na proporção de 10:1 e desgaseificar sob vácuo durante pelo menos 10 minutos.</li>
	<li>Coloque um mestre de silício (ou mesmo uma réplica de epóxi ou poliuretano) num pedaço de papel alumínio ininterrupta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura PDMS a desgaseificado sobre o mestre a uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Degas a placa de Petri de pelo menos 10 min. Use uma ligeira corrente de ar para quebrar as bolhas de superfície. Nota: As dimensões do dispositivo dois-tiered utilizados são fornecidas no acompanha arquivo CAD.5 (Veja o arquivo complementar 1). Um mestre de réplica de plástico pode flutuar parcialmente durante a desgaseificação; Se isso ocorrer, pressione a réplica com um aplicador de plástico limpo.</li>
	<li>Cura de PDMS para pelo menos 1 h em estufa a 60 ° C e esfriar até a temperatura ambiente. Retire o papel alumínio contendo o PDMS mestre e curado da placa de Petri. Com cuidado, retire a folha de alumínio na parte de trás do mestre e, em seguida, Retire cuidadosamente o PDMS com o mestre. Nota: Como alternativa, PDMS podem ser curadas durante a noite à temperatura ambiente. A relativa fragilidade de um mestre de bolacha de silicone pode ser superada usando adesivo epóxi de vínculo permanentemente o wafer de uma polegada de 1/16-disco de alumínio de espessura do mesmo tamanho como a bolacha.</li>
	<li>Como uma bolacha normalmente inclui vários dispositivos microfluídicos com dimensões ligeiramente diferentes (ver arquivo complementar 1), corta um único dispositivo de tamanho usando um bisturi limpo e afiado. Nota: Para a rotina de trabalho de b. subtilis , use dispositivos com trincheiras de célula 1.0-µm de largura, que são marcadas com um C ou F no arquivo CAD que acompanha.</li>
</ol>2. dispositivo de perfuração e de ligação
<ol><li>Lugar um pedaço de escritório translúcido fita (ver Tabela de materiais) sobre lado padrão do dispositivo para aumentar a visibilidade das características padronizadas. As portas de entrada e saída são identificadas como áreas circulares em lados opostos dos canais fluídico visíveis (Figura 1). Para melhorar a sua visibilidade quando fazendo buracos no dispositivo para os pinos de entrada e de saída, marque as entradas e saídas com pontos usando um marcador de ponta fina. Nota: Para garantir que os pinos de entrada e saída não estão lotados, todos os outros canais é um soco, começando com o canal sob o designador alfabética para o dispositivo.</li>
	<li>Inverter o dispositivo PDMS para que lado padrão é baixo e perfurar o dispositivo para os pontos marcados usando um soco biópsia 0.75 mm; Descarte o punchings. Nota: Os dispositivos são perfurados com lado padrão para baixo porque o buraco gerado pelo soco biópsia normalmente é ligeiramente queimado onde o soco entra o polímero. Socar o dispositivo em uma orientação invertida garante que o buraco no lado padrão possui uma borda afiada.</li>
	<li>Usando um estereomicroscópio, certifique-se que os furos perfurados se sobrepõem com as áreas de entrada e saída do dispositivo. Use uma pinça de ponta fina para remover quaisquer fragmentos alheios de PDMS dos furos perfurados.</li>
	<li>Use fita adesiva para remover poeira de ambos os lados do dispositivo e local em uma placa de Petri limpa poliestireno. Prepare um vidro de tampa 22 x 40 mm, molhando com 100% de álcool isopropílico e esfregando com uma limpeza de salas limpas; seco com um fluxo de ar livre de poeira ou de azoto.</li>
	<li>Coloque o perfurado PDMS dispositivo recurso lado acima juntamente com o vidro limpo em um plasma de oxigênio líquido de limpeza.<ol>
<li>Plasma-tratar o dispositivo com as seguintes configurações: vácuo, mTorr 70; Ó2 pressão, mTorr 200; duração, 15 s; poder, 30 w. imediatamente depois que termina o período de tratamento de plasma, remover o dispositivo e a tampa de vidro do plasma líquido de limpeza.</li>
		<li>Inverta o PDMS e colocá-lo no centro da tampa de vidro, para que lado padrão entra em contato com o vidro; Certifique-se de que os canais de alimentação (correndo entre as áreas de entrada e saída) estão alinhados com o eixo longo do vidro tampa. Pressione suavemente para garantir que os selos PDMS contra o vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asse o dispositivo montado em um forno pelo menos 1 h a 60 ° C. Após o cozimento, verificar manualmente que o PDMS é ligadas ao vidro, empurrando suavemente em um canto do dispositivo. Nota: Uma vez que o dispositivo é ligado, ele deve ser usado em 24h, como o polímero se tornará cada vez mais hidrofóbico com o aumento de tempo após o tratamento de plasma.</li>
</ol>3. Microfluidic encanamento preparação
<ol><li>Corte comprimentos de polímero (diâmetro interno (ID) 0,02 polegadas, diâmetro externo (OD) 0.06 polegadas) de tubos de comprimentos adequados a partir da bomba de seringa ao aparelho de comutação (se usado) e o dispositivo quando montado no microscópio. Corte como muitos comprimentos como existem microfluidic lanes.</li>
	<li>Montar Y entroncamentos para válvulas de pressão (se estiver usando), corte e anexando 2-cm comprimentos de silicone flexível, tubulação (0,03 polegadas ID, 0,065 polegada OD) para as farpas superiores do "Y" e comprimentos de 1 cm de tubo de silicone para o barb inferior do "Y".</li>
	<li>Corte de 10 cm (ou apropriados) comprimentos de tubagem de polímero; conectá-los em uma extremidade para a junção de interruptor inserindo-os para os segmentos de tubulação do silicone 1 cm sobre o barb inferior do "Y". Conectá-los na outra extremidade para agulhas de 21G que foram removidos de seus adaptadores de seringa plástica e dobrados aproximadamente 90 ° aproximadamente 9 mm da extremidade da agulha.</li>
	<li>Agulhas sem corte 21G Conecte uma das extremidades dos segmentos de tubulação que será executado a partir as seringas ao aparelho de interruptor, inserindo as agulhas para o tubo. Insira as outras extremidades de cada comprimento de tubo dos segmentos de tubulação do silicone sobre as farpas de entrada dos cruzamentos a Y. Nota: Use algum tipo de aparelho para segurar as válvulas de pressão e as junções no lugar; Isto pode facilmente ser feito de uma caixa de dica micropipeta (Figura 2D).</li>
	<li>Comprimentos de tubo de polímero para transportar resíduos da tomada do dispositivo para um copo de resíduos de corte. Conectá-los em uma extremidade para agulhas torcidas de 21G preparado como descrito acima. Fita a outra extremidade dos tubos para um copo de resíduos.</li>
	<li>Preparar volumes adequados de meios contendo 0,1 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) e preencher o tamanho desejado e o número de seringas. Conecte as seringas BSA-carregado para as agulhas de 21G preparado anexadas para as seringas de tubos e carga de entrada em bombas de seringa. Nota: para o típicos experimentos 5 canais do dispositivo são usadas, cada um com uma seringa de 20 mL. Um experimento em que o meio é comutado exigirá 2 bancos de 5 seringas cada. Aqui, a bomba que contém o primeiro banco é referida como a bomba de fase-1, e a bomba que contém o segundo banco, com o pós-interruptor médio, é conhecida como a bomba de fase-2.</li>
	<li>Purgue o ar do encanamento a entrada executando as bombas de seringa em uma taxa de fluxo elevada (> 500 µ l/min), começando orientando as bombas de seringa verticalmente e tocando as seringas para trazer as bolhas de ar no topo. Uma vez que o ar tem sido purgado das seringas, coloque a bomba de seringa na horizontal e, progressivamente, toque ou folhear as linhas de polímero de seringas de aparato interruptor para desalojar e remover bolhas de ar. Repita este processo para o segundo banco de seringas (se a mídia de comutação).</li>
	<li>Depois que as bolhas de ar são limpos, defina a bomba de seringa de fase-2 (ou seja, com o meio que será usado segundo, após o interruptor) de 1,5 µ l/min, então pausar o fluxo. Coloque clips de fichário pequeno para os segmentos de tubulação flexível no ramo das junções de Y correspondente à segunda fase média. Continuar a funcionar a bomba de seringa de fase-1 a uma taxa de fluxo modesto (por exemplo, 10 µ l/min) durante pelo menos 30 min limpar o meio segundo da tubagem de entrada a jusante da junção Y.</li>
</ol>4. preparação de cultura de células
<ol><li>Cresce um preculture da estirpe de interesse a médio desejado durante a noite, a fase estacionária. A estirpe bacteriana deve conter uma mutação que processa as células imóveis, para que as células não nadar fora dos canais do dispositivo. Nota: No presente protocolo, a estirpe bacteriana é b. subtilis 3610 contendo uma bruxaA233V substituição (esta mutação faz com que o flagelo ser em linha reta ao invés de motilidade celular helicoidal, impedindo), um PrsbV- mNeonGreen repórter para estresse celular e constitutiva repórter Phyperspank- mNeptune (vermelho) para destacar células. Meio de Lennox LB é usado no protocolo de exemplo. Estirpes típicas para experimentos de microfluídica contêm um ou mais repórteres transcriptional fluorescentes e uma proteína fluorescente citoplasmática, constitutivamente produzida para facilitar a detecção automatizada de células. Defeitos de crescimento não foram observados quando rico meio LB Lennox foi usado, mas crescimento de b. subtilis em media mínimos pode ser inibido sob condições microfluidic porque secretado sideróforos são lavados pelo fluxo médio. Sob tais circunstâncias, crescimento pode ser restaurado pela adição de citrato de sódio e cloreto férrico ao meio, conforme relatado por S750 médio11.</li>
	<li>A manhã do experimento, dilua as células de b. subtilis 01:50 para um perplexo balão de 250 mL contendo 25 mL do meio de crescimento. Crescem as células para 5-6 h em sacudir a cultura a 37 ° C, com uma densidade óptica de maior que 1. Nota: Uma cultura de células densas é preferível porque estacionária-fase b. subtilis células são menores e menos célula muitas vezes encontrada em cadeias, facilitando o carregamento do dispositivo. Diferentes espécies bacterianas podem exigir outras condições médio ou crescimento de carregamento ideal.</li>
	<li>Usando uma seringa, equipada com um filtro de tamanho dos poros de 5 µm, filtre cerca de 15 mL de cultura de células para um tubo cônico de 15 mL para remover cadeias de célula b. subtilis (é desnecessário para Escherichia coli e pode não ser necessário com outras espécies). Nota: Relativamente poucas células devem ser removidas; o filtrado deve ser turvo.</li>
	<li>Centrifugar a cultura filtrada por 10 min a 4.000 x g, à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células no fluido sobrenadante residual remanescente no tubo, adicionando aproximadamente 500 µ l de meio fresco, se necessário, para facilitar a pipetagem a suspensão de eritrócitos.</li>
</ol>5. dispositivo carregamento
<ol><li>Coloque delicadamente vazia fina gel-carregamento micropipeta dicas (ver Tabela de materiais) para os orifícios de saída do dispositivo microfluidic.</li>
	<li>Usando pontas finas de gel de carregamento com uma micropipeta P200, passivate o dispositivo através da injeção de meio contendo 1 mg/mL BSA dentro dos orifícios de entrada, observando as dicas os orifícios de saída para monitorar o enchimento dos canais microfluídicos (Figura 2A). Incube o dispositivo à temperatura ambiente por cerca de 5 min. Nota: BSA é comumente usado como um bloqueio ou passivação agente que associará a superfície hidrofóbica do polímero PDMS, aumentando sua Hidrofilia e reduzindo a vinculação de outras proteínas ou células (através de moléculas de superfície celular).</li>
	<li>Usando pontas finas de gel de carregamento, carrega cada canal com as ressuspensa células (secção 4), usando as dicas no canal de saída para monitorar o progresso das células através do dispositivo (Figura 2B). Nota: O carregamento é facilitado definindo a P200 micropipeta para seu volume máximo 200 µ l e depois aspirar um coxim de ar antes de aspirar um pequeno volume (aproximadamente metade do volume da seção fina da ponta da pipeta) de células. O volume de ressuspensão células não precisa ser preciso, como o volume do dispositivo PDMS é pequeno em comparação com o da micropipeta. Sabemos de nenhum limite superior para a densidade das células ressuspensa, enquanto a suspensão de eritrócitos pode ser pipetada dentro do aparelho. Aglomerados de células podem obstruir o dispositivo e devem ser evitados por pipetagem completa e/ou mistura de vórtice.</li>
	<li>Remova suavemente as gel de carregamento dicas dos orifícios de saída, trabalhando um de cada vez para evitar danos ao dispositivo.</li>
	<li>Centrifugue o dispositivo numa bancada microcentrifuga em um adaptador apropriado do rotor a aproximadamente 6.000 x g durante 10 minutos (Figura 2). Nota: Utilizou-se um adaptador de rotor de alumínio usinadas personalizado que foi projetado para caber em um rotor de microcentrifuga (Figura 2); centrífuga de diferentes modelos pode ser usadas com adaptadores apropriados do rotor. A característica importante do adaptador é que ele fornece força lateral na direção das extremidades fechadas de trincheiras a célula, forçando as células nos canais de lado.</li>
	<li>Verificar carregamento bem sucedido sob o microscópio (Figura 3), mas sem a aposição do dispositivo para o slide titular/estágio inserir. Nota: No presente protocolo, um 60 X, 1.4 at Ph3 objectivo de imersão de óleo é usado para ambos verificação nesta fase e para a imagem latente subsequente.</li>
</ol>6. dispositivo montagem, equilibrio e montagem
<ol><li>Cuidadosamente, montar o dispositivo carregado para uma inserção de palco gravando o vidro de cobertura em ambos os lados do PDMS para a parte inferior da inserção da fase (ou seja, inverter a fase de inserção antes de fixar o dispositivo). Inverter o assembly de inserção-dispositivo de palco para que o PDMS é voltada para cima e coloque sobre uma superfície macia, como uma limpeza livre de poeira (Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar a vazão da bomba de seringa de fase-1 a 35 µ l/min. trabalhando com uma faixa de cada vez, inserir a agulha de entrada e, em seguida, a agulha de tomada (i.e., a correr para o recipiente de resíduos; Figura 2E).</li>
	<li>Limpe qualquer excesso de meio com uma toalhita de limpeza livre de poeira e inspecione visualmente o dispositivo para detectar possíveis vazamentos. Examine a tubulação de saída para o aparecimento de células em excesso (geralmente aparece como uma listra turva) e o menisco médio, que lentamente se moverá para o recipiente de resíduos.</li>
	<li>Permita que o dispositivo para executar em 35 µ l/min por aproximadamente 15-30 min, até que todas as pistas conectadas estão drenando para o copo de resíduos.</li>
	<li>Conjunto da bomba de seringa de fase-1 a 1,5 µ l/min e pausar o fluxo. Traga todo o aparelho bomba e dispositivo para o microscópio (este processo é auxiliado por colocá-lo todo em um carrinho de rolamento) e reiniciar o fluxo médio de 1,5 µ l/min. montar cuidadosamente a inserção do palco com o dispositivo em um microscópio de fluorescência invertido, fase-1 usando fita conforme necessário para rotear os tubos de saída e de entrada.</li>
	<li>Localizar posições desejadas no dispositivo para tratamento de imagens e começar a imagem conforme desejado. Observe que células tipicamente requerem algumas horas (aproximadamente 10 gerações) para atingir o estado estacionário fase exponencial de crescimento, e o início da aquisição de imagens pode ser retardado como desejado para que a imagem começa após o período de equilíbrio. Nota: O crescimento de estado estacionário de células em fase exponencial deve ser verificado durante a análise de imagem posterior acompanhamento de tempos de divisão celular e assegurando que eles chegaram a um valor mínimo constante.</li>
</ol>7. médias de comutação
<ol><li>Entre as sucessivas rodadas de imagiologia, pause o fluxo da bomba de seringa de fase-1. Com cuidado, solte os grampos da pasta de silicone fase 2 tubulação, movendo-se a cada um para o tubo do silicone na fase-1 filial da junção Y. Un-pausa o fluxo da fase-2 seringa da bomba (que foi definida como 1,5 µ l/min na etapa 3.8) e continuar a imagem latente. Nota: A 1,5 µm/min com um comprimento de 10 cm de polímero tubulação a jusante dos cruzamentos do Y, o meio da segunda fase atinge o dispositivo em aproximadamente 50 min. O tempo para o dispositivo pode ser empiricamente testado usando meios que contêm partículas de marcador fluorescente.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-cell+chemostat:+an+agarose-based,+microfluidic+device+for+high-throughput,+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities.">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li><li>Dusny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+bias+of+microcultivation+environments+on+single-cell+physiology.">Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology.</a> Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li><li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+and+modularity+in+cell-fate+decision+making.">Memory and modularity in cell-fate decision making.</a> Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).</li><li>Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Organ/Body-on-a-Chip+Devices+at+the+Convergence+of+Biology+and+Microengineering.">Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li><li>Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+analysis+of+C.+elegans+muscular+forces+and+locomotion+patterns+in+microstructured+environments.">On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments.</a> Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+distant+biofilms+and+emergence+of+nutrient+time-sharing.">Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing.</a> Science. 356 (6338), 638-642 (2017).</li><li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+cell-laden+microgels+using+double+emulsion+drops+with+a+sacrificial+ultra-thin+oil+shell.">One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell.</a> Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).</li><li>Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+meets+microbiology.">Microfabrication meets microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).</li><li>Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Physiology.">Single-Cell Physiology.</a> Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).</li><li>Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+physical+mechanisms+and+biofilm+processes:+review+of+microfluidic+methods.">Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods.</a> Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).</li><li>Yu, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+microfluidic+tracking+of+coccoid+cyanobacterial+cells+reveals+robust+control+of+division+timing.">Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing.</a> BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+constant+size+extension+drives+bacterial+cell+size+homeostasis.">A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis.</a> Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).</li><li>Taheri-Araghi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+control+and+homeostasis+in+bacteria.">Cell-size control and homeostasis in bacteria.</a> Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).</li><li>Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization,+competition,+and+dispersal+of+pathogens+in+fluid+flow+networks.">Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks.</a> Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).</li><li>Connell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+prokaryotic+social+behaviors+with+bacterial+"lobster+traps".">Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps".</a> MBio. 1 (4), (2010).</li><li>Long, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bacterial+adaptation+dynamics+at+the+single-cell+level+using+a+microfluidic+chemostat+and+time-lapse+fluorescence+microscopy.">Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy.</a> Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).</li><li>Okumus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+slowing-down+of+cytoplasmic+diffusion+allows+in+vivo+counting+of+proteins+in+individual+cells.">Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells.</a> Nat Commun. 7, 11641 (2016).</li><li>Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+circadian+oscillations+in+growing+cyanobacteria+require+transcriptional+feedback.">Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback.</a> Science. 340 (6133), 737-740 (2013).</li><li>Baker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable,+Pneumatically+Actuated+Microfluidic+Device+with+an+Integrated+Nanochannel+Array+To+Track+Development+of+Individual+Bacteria.">Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria.</a> Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).</li><li>Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+a+phosphorelay+drives+stochastic+entry+into+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis.</a> EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).</li><li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis.">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo de microfluídica é flexível, em que muitos dos passos podem ser modificados para otimizar o seu uso com uma determinada espécie ou cepa ou para uma finalidade específica. Com efeito, neste protocolo, fizemos modificações para o original de "máquina de mãe" conceito4 para otimizar seu uso com b. subtilis. Muitas vezes, as trincheiras em que as células estão confinadas constituem um recurso de camada única, Considerando que neste protocolo usamos trincheiras da dois-camada celular, com um canal raso em torno das células. O projeto da dois-camada foi introduzido como uma forma de maximizar o fluxo de nutrientes e metabólitos de células b. subtilis , especialmente em longo (> 75 µm) trincheiras5; no entanto, muitas vezes características de camada única é suficiente para o crescimento da célula ideal e são comumente usadas para Escherichia coli, especialmente quando eles são mais curtos (~ 25 µm)4. Normalmente usamos mais trincheiras, como reduzem a frequência com que cadeias de célula b. subtilis , que surgem estocàstica, são puxadas fora suas trincheiras pelo fluxo médio na alimentação principal canal5.
Outras modificações, tais como o uso de dispositivos com recurso de diferentes dimensões (por exemplo, larguras de canal) ou características (por exemplo, forma, número de extremidades abertas) podem ser substituídas conforme apropriado. Por exemplo, o uso de celulares que trincheiras que estão abrir em ambas as extremidades (em vez de apenas um fim, como no presente protocolo) tem sido utilizado em outros estudos,1,20,21. Trincheiras abertas em ambas as extremidades evitam envelhecimento celular, porque eles estão constantemente sendo preenchidos com células recém-nascido (em oposição a mãe máquinas, onde a célula mais antiga é controlada e novas células são empurradas fora do canal), embora o fato de que as células mais velhas são empurradas Se ambas as extremidades normalmente limita sua janela observacional para menos de 10 gerações1,21. Normalmente buscamos o mais observacional windows (centenas de gerações) oferecido por uma máquina de mãe, que tornam possível a medida nem memoryless processos para os quais os tempos de espera são dezenas ou centenas de gerações muito tempo5. Também usamos o design da máquina mãe observar células que não estão crescendo exponencialmente, como em nossas análises de esporulação22. Em tais casos, células adicionais durante o crescimento de trincheiras podem ser significativamente analisaram22.
Muitos dos passos no protocolo são relativamente indulgente em que eles podem ser modificados sem afetar substancialmente o resultado do protocolo. Por exemplo, uma versão anterior do protocolo chamado para limpeza do vidro de tampa por etapas de sonication sequencial de 10 min de banho em 10 M KOH e água pura em seguida, mas achamos que dispositivo boa ligação e operação foi conseguido usando o mais simples baseada em isopropanol limpeza passo descrito aqui. Se um problema de ligação se levantou essa suspeita de elenco sobre a limpeza do vidro tampa, revertendo para um protocolo de limpeza mais rígidas é recomendado. Da mesma forma, enquanto nós usamos uma centrifugação para maximizar a célula em trincheiras célula de carga, carregamento razoavelmente cheio pode ser alcançado mesmo sem este passo, desde que muito concentrado de células é usado para a etapa de carregamento. Esta estratégia alternativa pode ser especialmente útil para pesquisadores que não têm um adaptador de centrífuga prontamente disponível para girar o dispositivo. Mais uma vez, podem ser utilizadas diferentes concentrações do agente de passivação/lubrificação (BSA neste protocolo); rotineiramente usamos concentrações tão elevadas quanto 1 mg/mL. Em casos onde uma cepa pode ser sensível a BSA, resultados aceitáveis podem ser alcançados mesmo na ausência de um agente protector. Com efeito, quando estávamos a usar um dispositivo microfluidic para examinar a esporulação, que exige a fome celular, nós estávamos preocupados que BSA pode agir como uma potencial fonte de nutrientes para as células, e então nós omitidos, o fluxo médio sem observar qualquer substancial efeitos adversos22.
Notavelmente, o fluxo contínuo de mídia através do dispositivo pode provocar fenótipos ligeiramente diferentes em comparação com o crescimento de células em um sistema fechado, como um balão. Por exemplo, depleção de nutrientes ou composta pode ser um desafio, como células muitas vezes podem eliminar compostos de rastreamento do fluxo médio. Com efeito, temos observado que induzir a esporulação de célula através de fome exige mais tempo em um dispositivo microfluidic do que num balão. Da mesma forma, temos observado que a indução de estresse de energia usando a fosforilação oxidativa decoupler Carbonilcianeto m-clorofenil-hidrazona (CCCP) requer several-fold umas concentrações mais elevadas no dispositivo microfluidic de relatado na cultura de balão 23. portanto, alguma otimização pode ser necessária para obter resultados satisfatórios com diferentes aditivos médios.

Uma das características mais marcantes da vida na terra é sua grande resiliência e variedade. Um objetivo central da biologia molecular é entender a lógica pela qual células usam genes e proteínas para maximizar seu crescimento e aptidão sob uma ampla variedade de condições ambientais. Para atingir este objetivo, os cientistas devem ser capazes de observar com confiança como células individuais crescem, dividem e expressam seus genes sob um determinado conjunto de condições, observando como as células respondem às alterações subsequentes no seu ambiente. No entanto, os métodos analíticos tradicionais em microbiologia têm limitações técnicas que afetam os tipos de perguntas que podem ser abordados. Por exemplo, em massa baseada em cultura análises foram muito úteis ao longo dos anos, ainda oferecem somente os dados de nível populacional que podem mascarar variações significativas de célula para célula ou os comportamentos de menores sub-populações de células na população total. Análises de célula única de bactérias de vida baseadas em microscopia de luz revelam o comportamento de célula única, mas também são tecnicamente limitadas. Bactérias normalmente são imobilizadas em almofadas de agarose contendo meio de crescimento, mas multidões de crescimento e divisão de pilha a visão microscópica e esgota os nutrientes disponíveis após poucos ciclos de célula, limitando substancialmente o tempo de observação1, 2. Além disso, a local depleção de nutrientes e o concomitante acúmulo de subprodutos metabólicos devido ao crescimento celular estão mudando constantemente o ambiente de crescimento celular local de maneiras que são difíceis de medir ou prever. Tais mudanças ambientais usando almofadas de agarose representam um desafio para estudos de comportamentos de estado estacionário ou de respostas celulares para alterações específicas nas condições de crescimento3.
Microfluidic tecnologia, no qual um meio líquido é continuamente fluiu através de dispositivos microfabricated, oferece uma solução para limitações experimentais clássicas. Um dispositivo microfluidic pode manter células individuais em posição para microscopia de viver-pilha quando o fluxo do meio de crescimento constantemente fornece as células com nutrientes frescos e lava subprodutos metabólicos e células em excesso, criando assim um crescimento altamente uniforme meio ambiente. Sob condições de constante crescimento, observam-se comportamentos de célula isolada da influência de fatores ambientais, permitindo uma vista desimpedida da lógica interna das células. Como o fluxo de fluido impede que o dispositivo microfluidic tornando-se repleto de células, observação de linhagens de célula única para dezenas ou centenas de gerações torna-se possível4,5. Estes tempos de longa observação permitam a detecção de comportamentos de célula a longo prazo ou raro caso contrário indetectável. Finalmente, a composição do meio que flui através do dispositivo pode ser alterados no Irão, permitindo que as células a serem observados como eles respondem ao aparecimento de um estresse ou para a introdução ou remoção de um determinado composto.
Microfluídica já tem desfrutado de um número de aplicações importantes. Por exemplo, ela tem sido usada em tecido, órgão ou dispositivos de corpo-em-um-microplaqueta, em que vários tipos de células humanas são co cultivados para simular na vivo condição6; para o estudo do movimento de nematoides em ambientes microstructured7; para examinar as interações entre biofilmes bacterianos (e.g., 8); e para o encapsulamento e a manipulação de pequenos volumes de células ou de produtos químicos (por exemplo, 9). Dispositivos microfluídicos também tornaram-se cada vez mais populares no campo da microbiologia (para excelentes críticas, ver 10 e 11), especialmente como seu físico e propriedades de fluxo são bem-acompanhado para nichos microbianos naturais12. Por exemplo, microfluídica foi recentemente empregada por microbiologistas para tais fins como medir precisamente celular crescimento e divisão13,14,15, analisando o patógeno movimento16, monitoramento de sensoriamento de quórum17 e transições fisiológica18e para proteína contando com19, entre muitos outros exemplos. O método apresentado aqui é projetado especificamente para a análise de linhagens única célula bacteriana, ao invés de combinações de cepas ou espécies. O dispositivo microfluidic demonstrado aqui utiliza uma variação do "máquina de mãe" projeto4, em que as células são cultivadas arquivo único dentro de uma trincheira microfluidic com uma extremidade fechada e uma aberta; divisão e crescimento celular empurra as células descendentes cima e para fora a extremidade aberta para o fluxo de fluido. Nossas análises geralmente se concentram apenas na célula "mãe" que está confinada na extremidade fechada da trincheira. Consideramos este método como um avanço sobre anteriores leves baseado em microscopia célula única técnicas analíticas, tais como imobilização de células em almofadas de agarose. Enquanto b. subtilis é usado como um modelo aqui, o método também é aplicável a outras espécies de bactérias (Escherichia coli é um outro modelo comum; algumas espécies com tamanhos diferentes de célula ou morfologias podem exigir a fabricação de novos dispositivos com dimensões diferentes). O uso de repórteres fluorescentes para marcar células e visualizar as alterações na expressão gênica requer o uso de espécies geneticamente tractable; no entanto, análises de crescimento celular e morfologia são possíveis mesmo sem marcadores fluorescentes.
O presente protocolo exclui o processo de fabricar o mestre de silício usando photolithography, que tem sido amplamente descrito em outra parte5; mestres também podem ser facilmente terceirizados de microfabrication instalações. Ele inclui o molde de um dispositivo PDMS de um mestre de silicone reforçado; ligação do dispositivo com um pedaço de vidro de tampa; montando o microfluidic entrada e saída encanamento, incluindo pitada válvulas para permitir a comutação médio; passivação do dispositivo, preparando as células bacterianas e carregar o aparelho com as células bacterianas; anexar o encanamento para o dispositivo e desenroscada as células; e carregar o dispositivo em um microscópio de fluorescência para a imagem latente. Porque muitos imagem diferente de aquisição e processamento de software ferramentas podem ser usadas para visualizar e analisar dados diferentes de interesse4,5, imagens de exemplo são mostradas, mas os métodos de captura de imagem não estão incluídos neste protocolo.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td></tr><tr><td>0.75-mm biopsy punch</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td></tr><tr><td>Tygon flexible tubing ID 0.02&quot;, OD 0.06&quot;</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td></tr><tr><td>Silicone Tubing, 0.04&quot; ID, 0.085&quot; OD</td><td>HelixMark Standard Silicone Tubing</td><td>60-795-05</td><td>For pinch valves and Y-junction connection</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Used as passivation agent</td></tr><tr><td>ART Gel Pipet Tips (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>For loading the device with medium and cells</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&amp;mu;m Supor membrane</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>For filtering cultures before device loading</td></tr><tr><td>21-ga blunt needles, 1&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y connector with 200-series barbs, 1/16&quot; ID tubing, polypropylene</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>The company is AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; strain NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td></tr><tr><td>Gravity convection oven</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>for curing PDMS and baking assembled devices</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td></tr><tr><td>Scotch Magic tape, 3/4&quot; width</td><td>3M</td><td></td><td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &quot;office tape&quot; or &quot;adhesive tape&quot; in protocol)</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>To clean cover glass</td></tr><tr><td>Syring pump, 6 channel</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>a brand of dust-free wipes</td></tr></tbody></table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

Microfluidic tecnologia supera muitas das limitações que os métodos analíticos tradicionais em microbiologia. Ao contrário de métodos de cultura de massa, oferece resolução de célula única e longa observação vezes abrangendo centenas de gerações; ao contrário de agarose baseada em almofada microscopia, tem condições de crescimento uniforme que podem ser rigidamente controladas. Porque o fluxo contínuo de meio de cultura isola as células em um dispositivo microfluidic de variações imprevisíveis no ambiente químico local causada pelo crescimento celular e metabolismo, autênticas alterações na expressão gênica e crescimento celular em resposta a estímulos específicos podem ser observados com mais confiança. Bacillus subtilis é usado aqui como uma espécie de bactéria modelo para demonstrar uma máquina de"mãe"-digite o método para análise de celular. Mostramos como construir e interpretar um dispositivo microfluidic, carregá-lo com células, iniciar a geração de imagens microscópica e expor as células a um estímulo, passando de um meio para outro. Um repórter de stress-responsivo é usado como um exemplo para revelar o tipo de dados que podem ser obtidos por esse método. Nós também brevemente discutir aplicações desse método para outros tipos de experimentos, tais como análise de esporulação bacteriana.

Bem sucedida célula inicial de carregamento, avaliada por microscopia de contraste de fase, antes de fixar o encanamento microfluidic o dispositivo, seria considerada como tendo todos ou quase todos os canais do lado microfluidic contendo uma ou mais células bacterianas ( Figura 3A). Carga ideal mostraria várias células em cada canal, mas canais, no entanto, vão encher de células devido a crescimento celular durante o período de equilíbrio (Figura 3B). Pistas com carregamento pobre, em que relativamente poucos (< 50%) lado canais são carregados com células, pode ser usado, mas a densidade de dados resultante será menor devido ao menos linhagens de células, sendo fotografadas em cada posição de imagem.
Uma vez que o dispositivo é inicialmente carregado, ela é equilibrada, anexando o encanamento microfluídicos e meio que circula o dispositivo a uma taxa relativamente alta vazão de 35 µ l/min. A etapa de equilibração serve para remover as bolhas de ar e as células em excesso no canal de alimentação do dispositivo e encorajar as células nos canais de lado para começar a crescer. As células que são removidas do dispositivo em cima do fluxo médio, muitas vezes podem ser observadas a olho nu como uma banda de cor clara, movendo-se através da tubulação de saída para o recipiente de resíduos; o movimento de bandas serve como um indicador visual de que o fluido está fluindo normalmente através do encanamento e o dispositivo. Inspeção microscópica de um dispositivo equilibrada deve revelar algumas células confinadas em um único arquivo na maioria dos canais de lado (Figura 3B, 0 min).
Uma vez que um dispositivo equilibrado é colocado no microscópio sob fluxo em 1,5 µ l/min a 37 ° C, as células retomará uniforme e constante crescimento exponencial-fase ao longo de cerca de 2 h (Figura 3B). Constante crescimento exponencial deve ser verificado diretamente após a análise de imagem com a aparência de um platô no tempo de geração das células. Neste ponto, as células estão prontas para fluorescência e/ou brightfield imagem conforme desejado. Um dispositivo com êxito carregado e equilibrado pode normalmente ser fiavelmente fotografado por períodos de pelo menos 24 h (Figura 4A, C). Introduzir um interruptor médio (Figura 4A–C) expande a gama de experiências que pode ser realizado, mas também aumenta a frequência de eventos catastróficos-morte celular (Figura 4), presumivelmente através da introdução de ar bolhas que não foram removidas com êxito da tubagem. Outro evento que pode causar morte celular catastrófico é que aglomerados de células localizadas na entrada podem tornar-se desalojado e passam através do canal de alimentação, como mostrado na Figura 4. Não neste momento entendemos porque isso faz com que a morte celular catastrófica no dispositivo, e nós ainda não inventaram um método para evitar a ocorrência de tais eventos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do dispositivo microfluidic. Um dispositivo esquemático é mostrado aproximadamente à escala. O designador alfabético é rotulado juntamente com as zonas de entrada e saída que são perfuradas para conectar as agulhas sem corte-terminado. Normalmente, metade dos canais estampados são usados (sombreada cinza). As trincheiras da célula são orientadas para o designador. O arquivo CAD que acompanha (ver arquivo complementar 1) mostra todos os recursos do dispositivo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56901/56901fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig2.jpg"> Figura 2: Microfluidic passivação do dispositivo, carregamento de célula e equilibração. (A) A dispositivo ligado após passivação com meio contendo BSA. Dicas de gel de carregamento são mantidas nos orifícios de saída para monitorar a passagem do meio e as células através do dispositivo. O menisco médio é visível na parte fina das dicas de gel de carregamento (seta). (B) dispositivo após o carregamento do celular. As células são visíveis como uma camada branca translúcida em gel-carregamento dicas (seta). (C) o gel de carregamento dicas são removidas antes da centrifugação em um adaptador personalizado-fabricadas centrífuga. Esparadrapo (azul) é colocado sobre as peças de alumínio para amortecer o dispositivo. (D) após centrifugação e verificação do carregamento, o dispositivo é gravado para uma inserção de palco do microscópio e encaixado nos pinos de entrada e saída. Na imagem mostrada, comutação médio é tornada possível por válvulas de pressão e Y-conectores que estão dispostos em um aparelho feito de uma caixa de ponta da micropipeta. (E) visão esquemática de um dispositivo montado inteiro, desde as bombas de seringa para o recipiente de resíduos. O tubo de saída é executado para um copo pequeno de resíduos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56901/56901fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig3.jpg"> Figura 3: célula de carga e crescimento no dispositivo microfluidic. (A) da esquerda para a direita, micrografias de contraste de fase de um dispositivo contendo meio apenas antes do carregamento do celular, o mesmo dispositivo depois que as células foram adicionadas via pipetagem, mas antes de centrifugação e o mesmo dispositivo após o carregamento de centrífugo. (B) curso de tempo de adaptação celular e crescimento do dispositivo (LB, 37 ° C, vazão de 1,5 µ l/min). No início da adaptação, as células em fase estacionária são relativamente curta e estreita. Como as células se adaptar e voltar à fase exponencial de crescimento (60-120 min), adoptarem uma morfologia mais longa e mais larga. Após 120 min, todas as células no dispositivo estão retomando o uniforme-fase exponencial de crescimento, e o dispositivo está pronto para a imagem latente. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56901/56901fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig4.jpg"> Figura 4: crescimento e meio de comutação no dispositivo microfluidic celular. (A) Kymographs mostrando 550 min de crescimento antes e 1.000 min de crescimento após a mudança de média (linha tracejada cinza) em 2% de etanol como um fator de estresse. Imagens foram capturadas em intervalos de 10 minutos. O painel superior mostra um repórter mNeonGreen transcriptional (canal verde) para um gene induzida por estresse. O painel inferior mostra um repórter mNeptune constitutiva (canal vermelho) que é usado neste caso de segmentação de célula automatizada. Ver os (B) close-up das parcelas dos kymographs na caixa tracejada no painel A, mostrando uma resposta transitória no canal da mancha verde, seguindo o médio do interruptor. Observe que o crescimento continua através do interruptor, embora a presença do etanol faz com que as células tornam-se mais curtos e crescer a um ritmo ligeiramente mais lento. Escala de tempo é mostrada pela barra horizontal e distância é mostrada pela barra vertical. (C) exemplo rastreia de dados analisados fluorescência de uma linhagem de célula única do experimento mostrado no painel A. As linhas verticais tracejadas indicam o médio do interruptor em 2% de etanol como um fator de estresse. (D) exemplo de um falhado médio do interruptor. Quando o segundo médio atinge as células, as células nos canais lysed. O interruptor é acompanhado por um grande número de células que passam no canal principal, causando um sinal fluorescente brilhante (uma imagem em re-escala correspondente à região desbotada é mostrada logo acima). Após a mudança, não há mais células são observadas, embora os restos da célula palidamente fluorescente permanece nos canais. Escala de tempo é mostrada pela barra horizontal e distância é mostrada pela barra vertical. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56901/56901fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K visualizações.  Oklahoma State University. Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Vídeo: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Imunologia e Infecção

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Bioengenharia

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

Combinando dispositivos fluidos com microscopia e citometria de fluxo para estudar transporte microbiano em mídia porosa em escalas espaciais

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Ambiente

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Biologia

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Aprimoramento da Enumeração de Esporos de Bacillus subtilis e Análise de Marcação em Citometria de Fluxo

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Bioquímica

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...