El objetivo general de este procedimiento es observar el impacto del gen SOX5 en la complejidad de las neuronas de arborización dendrítica durante el desarrollo neuronal en Drosophila. Este método puede ayudar a estudiar la morfogénesis de las neurodendritas, y la función génica en el desarrollo del sistema nervioso, para entender mejor los genes de la enfermedad neurodegenerativa. En última instancia, esta técnica proporciona un análisis cuantitativo de la complejidad de las dendritas, que se puede utilizar en muchos tipos diferentes de neuro-dendritas.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el mecanismo genético de la enfermedad neuro-degenerativa, porque la mutación tiene la clave para entender la función génica. Configuración de cruces de UAS-GFP;ppk-GAL4 con las moscas de tensión UAS-Sox102F-RNAi o controles W118. Cultivar las moscas en condiciones estándar a 25 grados centígrados.
En unos cinco a seis días, utilice fórceps para recoger cuidadosamente las larvas de la tercera estrella para la disección. Coloque una larva en un plato de disección hecho de base de elastómero de silicio, y un plato petri de cultivo de tejido. A continuación, coloque el plato debajo del microscopio de disección.
Ahora fija la cola de la larva para exponer la línea media. A continuación, fijar la boca de larva se engancha para que el lado dorsal de la larva está hacia arriba. Ahora agregue 200 microlitros de PBS al plato para sumergir la larva en solución.
A continuación, cortar la cola y la boca de larva con pequeñas incisiones. Luego corta la larva a lo largo de la línea media dorsal y entre las dos tráqueas, pasando de caudal a rostral. A continuación, coloque un alfiler en cada una de las cuatro esquinas del cuerpo para que el cuerpo se acueste plana.
Ahora fija la pared corporal de la larva en un cuatro por ciento de PFA durante 25 minutos a temperatura ambiente. Luego lave la larva con PBS tres veces durante cinco minutos por lavado. Después de los lavados, retire los pasadores y transfiera el tejido a un portaobjetos de vidrio.
A continuación, sumerja el tejido en un medio de montaje antifada y móntelo con un resbalón de cubierta. Deje que el tejido montado se seque al aire durante una hora antes de sellar en el resbalón de la cubierta con esmalte de uñas. Almacene estos portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados centígrados.
Captura imágenes de la serie z con un microscopio confocal usando un objetivo 20X. En primer lugar, establezca el rango de los pasos z para incluir todas las neuronas DA en la pared del cuerpo de la larva, y establezca el tamaño del paso en medio micrómetro. A continuación, almacene las imágenes como archivos TIF o ND2 para su procesamiento.
A continuación, evalúe el número y la morfología de las dendritas en las neuronas del DA. Comience con la evaluación de sus longitudes. En primer lugar, en Fiji ImageJ, divida las imágenes en canales separados si es necesario.
Solo es necesario evaluar el canal GFP. A continuación, haga una proyección z. En la nueva ventana, seleccione intensidad máxima para el tipo de proyección y elija los sectores de inicio y detención.
A continuación, haga clic en Aceptar para producir una imagen de proyección z con proyecciones claras de dendrita. Ahora trace las neuritas usando la herramienta plug-in. Primero, ve al soma de la neurona de interés y haz clic donde una dendrita emerge del cuerpo celular.
A continuación, haga clic en la punta de esta dendrita. Si la línea azul que conecta los dos puntos recorre la longitud del neurito, presione Y para sí. A continuación, si esta línea se ajusta a la ruta completa del neurito, haga clic en ruta completa.
Si la línea no se ajusta al trazado, haga clic en puntos más a lo largo de este neurito para doblar el trazado en varios segmentos de línea que se ajusten a la longitud del neurito. A continuación, haga clic en ruta completa y continúe marcando la ruta para el siguiente neurito. Después de completar todas las rutas de seguimiento, seleccione la opción Análisis, Medir rutas para exportar las rutas a un archivo CSV.
Utilice estos datos para calcular y el valor medio de las longitudes de ruta para el análisis. A continuación, calcule el área superficial de la neurona. En primer lugar, seleccione la herramienta de dibujo a mano libre en la ventana De Fiji ImageJ.
A continuación, conecte los puntos finales de la neurona de interés. A continuación, seleccione la opción Medir en la ventana Analizar. El resultado aparece en un nuevo cuadro con el valor del área seleccionada.
Copie este valor en el software de análisis de datos. Por último, calcule el número total de ramas utilizando el complemento Analizar rutas esquelizadas. Las dendritas de las neuronas DA fueron etiquetadas por coexpresar la GFP en sus árboles de soma y dendrita para el análisis de imágenes de florescencia de GFP.
La morfología de las dendritas fue imán usando un microscopio confocal invertido. Las dendritas de las neuronas del da y el aire común fueron rastreadas como se describe. El archivo se utilizó para estimar la longitud de la dendrita.
El silenciamiento de Sox102F en las neuronas DA en la tercera larva instar condujo a una reducción significativa en el número total de dendritas con aproximadamente la mitad de la longitud de la rama y con una estructura más simple, mostrando sólo la mitad del número de ramas. Lógicamente, esto llevó a la reducción de la superficie del eje. Este protocolo proporciona un método rápido para evaluar el desarrollo de las neuronas sensoriales DA.
Al intentar este procedimiento, asegúrese de tomar un gran número de imágenes de cada grupo de neuronas DA para obtener una buena cobertura. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de dendrita para responder preguntas adicionales sobre el desarrollo de dendrita. Desde su desarrollo, esta técnica ha ayudado a los investigadores en el campo de las neurociencias a hacer inferencias en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer utilizando sistemas modelo.
