El estudio fue apoyado por una subvención de los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Dental e investigación craneofacial (DE025030).

El protocolo que se describe a continuación fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso y sigue las normas éticas establecidas por los institutos nacionales de salud. Todos los datos presentados en este informe se generaron mediante el uso de ratones femeninos que fueron 10-12 semanas de edad. Se utilizaron las siguientes cepas de ratones: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S y F1 (B6XA/J). Todos los ratones fueron alojados en jaulas de barrera (a 5 animales por jaula) en condiciones libres de patógenos específicas y proporciona alimento y agua ad libitum.
1. preparación
<ol><li>Para preparar una solución de clorhidrato de pilocarpina, pesan 10 mg de compuesto y disolver en 1,776 mL de solución salina isotónica estéril con un vórtex, para dar una solución stock de 5,63 mg/mL. No hay necesidad de esterilizar esta solución. Pero si lo desea, filtrarla por un filtro de 0.2 μm. Almacenar esta solución en múltiples alícuotas en un congelador de-80 oC hasta por 3 meses. Cada helado es de un solo uso. Una vez descongelado, no vuelva a congelar la solución de pilocarpina.</li>
	<li>Tomar 0,6 mL de los tubos del microfuge y cuidadosamente perforar un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo con una aguja de calibre 18 climatizada. Coloque estos tubos en tubos de 2 mL. Los tubos no necesitan ser estériles.</li>
	<li>Usando una hoja de afeitar afilada, estéril, cortar esponjas absorbentes cilíndricos en trozos de unos 2 cm de longitud. Cortar cada 2 cm diagonal para dar 2 torundas de forma cónicas. Coloque una torunda en cada uno de los tubos de microcentrífuga de 0.6 mL.</li>
	<li>Pesar el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL que contiene el hisopo seco.</li>
	<li>La transferencia de los ratones que se estudiarán en una nueva jaula limpia con botellas de agua. Mantener los ratones sin alimentos durante al menos 2 h antes del inicio de la colección de saliva para evitar que las partículas de alimentos contaminen la saliva recogida. Nota: No es necesario tener 1 ratón por jaula para este procedimiento. Sin embargo, el número de ratones en cada jaula depende de reglas específicas de la institución y de uso animal.</li>
	<li>Justo antes del final de 2 h, preparar la solución de pilocarpina de trabajo (0,0563 mg/mL) diluyendo la solución madre 100 x en solución salina estéril. No es necesario más filtro esterilizar esta solución. Mantenga siempre la solución de trabajo de la pilocarpina en el hielo. Nota: La tabla 1 muestra la cantidad de pilocarpina que se inyecta para un rango de peso corporal de ratón para darle una última dosis de 0,375 mg/kg peso corporal.</li>
</ol>2. procedimiento
<ol><li>Peso de cada ratón y determinar la dosis de la mezcla anestésica para cada ratón utilizando la tabla 1. Inyectar el primer ratón con el volumen adecuado de la mezcla anestésica por vía intraperitoneal. Ajuste el temporizador durante 2 min (mayoría de las cepas de ratón en este protocolo de ir a dormir por 2 min). Asegúrese de que el ratón correctamente está anestesiado por la falta de caminar cuando se coloca sobre una superficie plana. Si el ratón está caminando todavía, espere 2 minutos adicionales antes de proceder al siguiente paso. Aplique una gota de lubricante pomada oftálmica en ambos ojos para evitar que se sequen. Nota: En la tabla 1, la dosis de la mezcla anestésica es 0,007 mL/g de peso corporal. El rango óptimo para este procedimiento es 0.006 a 0.008 mL/g de peso corporal. Sin embargo, después de 4 minutos, si el ratón está todavía caminando o exhibir movimientos espasmódicos, consultar con el veterinario institucional para aumentar adecuadamente la dosis del anestésico.</li>
	<li>Determinar la dosis de pilocarpina para el ratón utilizando la tabla 1 e inyecte la cantidad apropiada por vía intraperitoneal. Ajustar el temporizador de 2 minutos y colocar el ratón en el tubo de limitador de 50 mL hasta que la cabeza y las orejas sobresalen el extremo cortado. Coloque el tubo en un ángulo de 45 grados, con la cabeza hacia abajo y la superficie ventral hacia arriba. Con cinta adhesiva el tubo a la Junta Directiva de procedimiento para guardarlo de la mudanza. Nota: Tabla 1 proporciona dosis de ratones más de 17 g, como este procedimiento no se ha intentado en ratones debajo de 17 g de peso.</li>
	<li>Al final de 2 minutos, suavemente inserte un par cerrado de micro fórceps de disección en la boca y levante la mandíbula inferior hacia arriba para abrir la boca. Empujar la pinza 1-2 mm más en la boca, asegurándose de que la lengua se ve apoyada en el brazo superior de las pinzas. Con otro par de Pinzas finas, mantener el hisopo seco previamente pesado cerca de su extremo cónico.</li>
	<li>Deslice suavemente el extremo cónico de la esponja en la boca. Retirar las pinzas dejando la punta de la torunda en la cavidad bucal.</li>
	<li>Sujete el extremo más ancho de la torunda que se extiende fuera de la boca y girar para permitir que la superficie máxima de contacto con la boca. Mantener el hisopo en esta posición durante 15 minutos. Nota: Esto asegura que el hisopo permanezca en la boca para la duración de la colección. Tenga en cuenta que el extremo cónico de la torunda actúa como una mecha y la parte más ancha de la esponja permanece fuera de la boca.</li>
	<li>Al final de 15 minutos, suavemente gire el hisopo para recoger cualquier saliva que no ha sido absorbida y colocar el hisopo mojado en el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL. Cierre el tubo y colóquelo en el tubo de 2 mL a hielo. Nota: En este momento, la mucosa oral aparece completamente seca. El ratón puede ahora mover hacia atrás en su jaula para la recuperación de la anestesia.</li>
	<li>Transferir el ratón en la jaula. Coloque bolitas de alimento húmedo en la jaula después de la recolección de saliva para ayudar a la rehidratación más rápida. Nota: Los ratones se despiertan dentro de 10 minutos después del final de la colección. Inyección subcutánea de solución salina isotónica con 0.2 mL se puede administrar también para acelerar la recuperación.</li>
	<li>Proceder al próximo ratón. Todos los ratones deben ser vigilados hasta que han recuperado completamente y son ambulatorios.</li>
</ol>3. las mediciones
<ol><li>Al final de todas las colecciones, pesar los tubos 0.6 mL con el hisopo mojado. Calcular la diferencia entre el peso húmedo y peso seco para obtener el peso de saliva producida. Coloque el tubo de 0.6 mL con saliva en el tubo de 2 mL.</li>
	<li>Cortar las tapas de los tubos de 2 ml. Luego, centrifugar los tubos de 2 mL por 2 min a x 7500 g, a 4oC en una micro centrífuga para recuperar la saliva. Medir el volumen de saliva obtenido usando una micropipeta.</li>
	<li>Los resultados se expresarán como saliva peso (mg)10 sobre 15 minutos o como una relación de peso de saliva (mg) / peso (g) del ratón. Nota: Si se ha medido el volumen de saliva extraída de la torunda, expresar los resultados como el volumen de saliva recuperado (mL) o el cociente del volumen de saliva (mL) peso (g) de ratón.</li>
</ol>

<ol><li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+salivary+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol+2000%22%5BJournal%5D)">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li>
<li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16039337">Sjögren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li>
<li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xerostomia+and+its+predictors+following+parotid-sparing+irradiation+of+head-and-neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).</li>
<li>Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+secretion+rates+from+mouse+and+rat+parotid+glands+are+markedly+different+following+pilocarpine+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation.</a> Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).</li>
<li>Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li>
<li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li>
<li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li>
<li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome-like+disease+in+%28NZB+x+NZW%29F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome-like+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li>
<li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li>
<li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li>
<li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li>
<li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine%3A+teaching+an+old+drug+new+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

La producción de saliva es un proceso complejo y está influenciada por muchos factores. Por lo tanto, la función de la glándula salival en animales de laboratorio de medición puede ser un desafío. Un desafío adicional es que mediciones repetidas de la función de la glándula salival en el mismo animal son necesarias para establecer el inicio de la enfermedad o para demostrar la recuperación después del tratamiento.
El método de hisopo que se describe en este informe es técnicamente...

Las glándulas salivales producen la saliva en respuesta a una variedad de estímulos neurológicos y mecánicos1. Los estímulos son llevados a través del sistema nervioso simpático y parasimpático a los receptores adrenérgicos y colinérgicos en la glándula. La pilocarpina es un agente colinérgico, párr simpaticomimético que actúa predominantemente sobre los receptores muscarínicos. En las glándulas salivales, induce la producción de saliva actuando sobre el receptor muscarínico M31. La producción de saliva tras la administración de pilocarpina es un indicador de la capacidad de responder a la estimulación de las glándulas salivales y es comúnmente usada como una medida de la función de la glándula salival.
Medición precisa de la producción de saliva es importante en el estudio de enfermedades de las glándulas salivales como síndrome de Sjögren2 y lesión por radiación después de tratamiento de cáncer de cabeza y cuello3. Varios métodos se han desarrollado para medir la producción de saliva de roedores. Estos incluyen directa canulación del conducto excretor salival4, colección de saliva desde la cavidad bucal bajo vacío5y colección mediante tubos capilares de cristal6 o una micropipeta7,8, 9. dirigir la canulación del conducto salival proporciona la más precisa y pura saliva. Sin embargo, este es un procedimiento técnicamente difícil, y el potencial para causar lesión ductal excluye colecciones repetitivas saliva del mismo animal. Recogida de saliva bajo vacío puede llevar a resultados variables debido a la sequedad de la saliva del tubo. Esta pérdida es aún más exagerada en ratones con disminución de la salivación. Capillares de vidrio permiten la recogida de saliva para análisis posteriores, sin embargo, cambios en la viscosidad de la saliva secretada en el estado enfermo impide eficiente llenado del tubo capilar. Además, intenta barrer la cavidad bucal para recoger saliva residual puede provocar lesiones. El método de pipeta permite la colección completa, y para el mismo operador, es notablemente consistente entre experimentos. Sin embargo, por razones desconocidas, este método muestra una variación significativa entre los diferentes operadores. Por lo tanto, para permitir comparaciones apropiadas, resulta imprescindible que el operador mismo realiza todos los experimentos relacionados con un proyecto específico. Claramente, esto representa una gran desventaja para un laboratorio.
Para superar estos problemas, se desarrolló un procedimiento que combina métodos de recolección de saliva se utilizan para los seres humanos y roedores. El método del hisopo, que se describe a continuación para medir el volumen de saliva inducida por la pilocarpina es simple, reproducible, no influenciado por el operador y puede realizarse varias veces en el mismo animal. Además, permite recoger la saliva para el posterior análisis de las proteínas, inmunoglobulinas o de otras biomoléculas.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthesia Mix solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td><td>RXANASED-20</td><td>Stock is 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Isotonic sterile saline</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Used as diluent</td></tr><tr><td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td><td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td><td>48272</td><td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Children&#039;s swab</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Individually wrapped swabs</td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tubes</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge regular bevel needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blade #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&quot; length</td></tr><tr><td>Label tape</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>3 channel timer</td><td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adjuvant</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td><td>Generated in lab</td><td></td><td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ Kits for saliva analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary lysozyme estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td><td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary IgA estimation by sandwich ELISA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgA</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary protein estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>BioRad, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>For protein estimation as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr></tbody></table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

Pacientes con síndrome de Sjögren, una enfermedad autoinmune que afecta las glándulas exocrinas, desarrollan inflamación de la glándula salival y han reducido la producción de saliva. Del mismo modo, la producción de saliva está comprometida seriamente en pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello. Modelos de roedores, desarrollados para imitar estas condiciones clínicas, facilitan la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y permitan el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, la capacidad precisa, reproducible y varias ocasiones medir la función de la glándula salival en modelos animales es fundamental. Basándose en procedimientos previamente descritos en la literatura, que cumple estos criterios y se utilizó para evaluar la función de la glándula salival en ratones se desarrolló un método. Una ventaja adicional de este nuevo método es que se domina fácilmente y tiene poca variación inter-operador. Función de la glándula salival se evalúa como la cantidad (peso o volumen) o (mL/min) de la saliva producida en respuesta a la estimulación de la pilocarpina. La recogida de la saliva es una buena fuente para el análisis de contenido de proteína, las concentraciones de inmunoglobulinas y otras biomoléculas.

En los sistemas de modelo experimental de ratón, la capacidad de producir saliva en respuesta a la estimulación de la pilocarpina se utiliza como un indicador de la función de la glándula salival. La producción de saliva se midió en ratones hembra de 11 semanas de edad C57BL/6 por el método de esponja. En la figura 1A, los resultados se expresan como la cantidad de saliva (mg) recogido después de cada vez mayor dosis de pilocarpina. A la dosis de 1 mg...

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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

a-method-for-the-measurement-of-salivary-gland-function-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.6K vistas.  Oklahoma Medical Research Foundation. Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Video: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Investigación

Medicina

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biología

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Inmunología e Infección

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Aislamiento de células epiteliales salivales de glándulas salivales humanas para el crecimiento in vitro como salisferas o monocapas

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imágenes en vivo en tiempo real de la regeneración de la glándula submandibular del ratón

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autor destacado: Estudio de las interacciones entre macrófagos y células epiteliales en la regeneración de glándulas salivales después de una lesión 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Resumen

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Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

Aislamiento de células epiteliales salivales de glándulas salivales humanas para el crecimiento in vitro como salisferas o monocapas

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo