연구는 국립 보건원, 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (DE025030)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

아래에 설명 된 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 그것은 건강의 국가 학회에 의해 설립 하는 윤리적인 지침을 따릅니다. 이 보고서에 제공 된 모든 데이터는 10-12 주 나이의 여성 쥐를 사용 하 여 생성 되었습니다. 쥐의 다음 긴장 사용 했다: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S, 및 (B6XA/J) F1. 모든 마우스 장에 장벽 (5 동물 케이지 당) 특정 병원 체 자유로운 조건에서 지 내게 되었고 먹이 물 ad libitum 제공.
1입니다. 준비
<ol><li>Pilocarpine 염의 재고 솔루션을 준비, 화합물의 10 밀리 그램의 무게 그리고 vortexing, 5.63 mg/mL의 재고 솔루션을 제공 하 여 살 균 isotonic 식 염 수의 1.776 mL에 녹이 지. 이 솔루션을 소독 아무 필요도 없다. 하지만 원하는 경우 0.2 µ M 필터를 통해 필터링. 최대 3 개월까지-80 oC 냉장고에 여러 aliquots에서이 재고 솔루션을 저장 합니다. 각 냉동된 주식은 단일 사용 됩니다. 일단 해 동, pilocarpine 솔루션을 refreeze 하지 마십시오.</li>
	<li>0.6 mL microfuge 관을 신중 하 게 온수 18 게이지 바늘으로 각 튜브의 하단에 작은 구멍을 펀치. 이러한 튜브 2 mL 튜브로 설정 합니다. 튜브 살 균 될 필요가 없습니다.</li>
	<li>샤 프, 메 마른 면도칼 블레이드를 사용 하 여 조각 길이 약 2 ㎝ 원통형 흡수 성 면봉 잘라. 2 원뿔 모양의 면봉에 게 대각선 각 2 cm 조각 잘라. 각 0.6 mL microfuge 관 한 면봉을 배치 합니다.</li>
	<li>무게 0.6 mL microfuge 관 마른 면봉을 포함 하는.</li>
	<li>전송으로 새로운 깨끗 한 물 병 공부 하 쥐. 수집 타 액 오염에서 음식 입자를 방지 하기 위해 타 액 컬렉션의 시작 이전에 적어도 2 시간에 대 한 음식 없이 마우스를 유지. 참고: 그것은이 절차에 대 한 감 금 소 당 1 마우스를 유지 하는 데 필요한 아니다. 그러나, 각 장에 배치 하는 쥐의 수는 특정 기관의 규칙 및 동물 사용에 대 한 규정에 따라 다릅니다.</li>
	<li>2 h의 끝의 바로 전에 멸 균 식 염 수에 재고 솔루션 100 배 희석 하 여 작업 pilocarpine 솔루션 (0.0563 mg/mL)을 준비 합니다. 추가 필터를 필요는 없습니다이 솔루션을 소독. 항상 작업 pilocarpine 솔루션 얼음에 보관 합니다. 주: 표 1 pilocarpine 마우스 몸 무게 줄 마지막 복용량 0.375 mg/kg의 체중의 범위에 대 한 주입을 금액을 제공 합니다.</li>
</ol>2입니다. 절차
<ol><li>각 마우스 무게 고 각 마우스를 사용 하 여 표 1에 대 한 마 취 혼합의 복용량을 결정 합니다. 복 경로 의해 마 취 혼합의 적절 한 볼륨으로 최초의 마우스를 주사. (대부분 마우스 긴장이이 프로토콜에서 테스트로 이동 자 2 분) 2 분 타이머를 설정 합니다. 마우스가 제대로 걷는 때 평평한 표면에 배치의 부족에 의해 마 취를 확인 합니다. 마우스는 여전히 걷고, 다음 단계로 진행 하기 전에 추가 2 분 동안 기다립니다. 건조를 방지 하기 위해 두 눈을 윤 활 유 안과 연 고의 한 방울을 적용 합니다. 참고: 테이블 1의 마 취 혼합의 복용량은 0.007 mL/g 몸 무게. 이 절차에 대 한 최적의 범위 0.006 0.008 mL/g 몸 무게는. 그러나, 4 분, 마우스는 여전히 산책을 하거나 육 포의 움직임을 전시 하는 경우 적절 하 게 증가 하는 마 취의 복용량에 대 한 제도적 수 의사와 상담 후.</li>
	<li>표 1 을 사용 하 여 마우스에 대 한 pilocarpine의 복용량을 결정 하 고 복 경로 의해 적절 한 금액을 투입. 2 분 타이머를 설정 하 고 머리와 귀 스틱 컷된 쪽으로 때까지 50 mL restrainer 튜브에 마우스를 삽입 합니다. 장소, 머리는 45도 각도로 튜브 및 위 복 부 표면. 이동에서 계속 절차 보드 튜브 테이프. 주: 표 1 제공 합니다 복용량을 17 g 보다는 마우스에 대 한이 절차가 쥐 17 g 아래의 무게에 시도 하지 않은.</li>
	<li>2 분의 끝에, 부드럽게 입으로 집게를 해 부 마이크로의 닫힌된 쌍을 삽입 하 고 입 열을 위쪽으로 아래 턱을 들어. 입, 혀는 집게의 최고 팔에 볼 다는 것을 확인에 집게를 1-2 m m 더를 밀어. 또 한 쌍의 좋은 집게, 원뿔 끝 가까이 미리 무게 마른 면봉 붙.</li>
	<li>부드럽게 입으로는 면봉의 원뿔 끝을 밀어. 구강에는 면봉의 끝 동안에 집게를 철회 한다.</li>
	<li>입 밖으로 확장 하는 면봉의 넓은 끝을 잡고 그것을 회전 입과의 접촉의 최대 영역을 허용 하도록. 15 분 동안이 자리에는 면봉을 유지. 참고: 이렇게 하면 면봉 컬렉션 동안 입안에 남아 있습니다. 면봉의 원뿔 끝 역할 심지와 면봉의 넓은 부분을 참고 입 밖으로 남아 있습니다.</li>
	<li>15 분의 끝에, 부드럽게 흡수 되지 어떤 타 액을 수집에 면봉을 회전 하 고 0.6 mL microfuge 관에서 젖은 면봉을 배치. 튜브를 닫고 얼음에 2 mL 튜브에 그것을 설정 합니다. 참고:이 시점에서 구강 점 막이 나타납니다 완전히 건조. 마우스 이제 이동할 수 있습니다 다시 그것의 감 금으로 마 취에서 회복을 위한.</li>
	<li>장에 마우스를 전송 합니다. 빠른 재 수 있도록 타 액 수집 후 장에 moistened 음식 펠 릿을 놓습니다. 참고: 쥐를 컬렉션의 끝 후 10 분 이내를 시작. 0.2 mL 미리 따뜻하게 isotonic 식 염 수의 피하 주사도 회복을 가속 화 하기 위해 주어진 수 있습니다.</li>
	<li>다음 마우스를 이동 합니다. 모든 그들은 완전히 복구 될 때까지 모니터링 해야 하는 쥐와는 보 행.</li>
</ol>3입니다. 측정
<ol><li>모든 컬렉션의 끝에, 젖은 면봉 0.6 mL 튜브 무게. 젖은 무게와 타 액 생산의 무게를 건조 무게의 차이 계산 합니다. 2 mL 튜브에 다시 타 액 0.6 mL 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>2 ml 튜브의 뚜껑을 잘라. 그런 다음 복구는 타 액을 마이크로 원심 분리기에 4oC에서 7500 x g에서 2 분 동안 2 mL 튜브 원심. micropipette를 사용 하 여 얻은 타 액의 양을 측정 합니다.</li>
	<li>타 액 무게 (mg)10 15 분 이상 또는 타 액 무게 (mg)의 비율으로 결과 표현/몸 무게 (g) 마우스. 참고: 면봉에서 추출 하는 타 액의 양을 측정 하는 경우 타 액 복구 (mL)의 볼륨 또는 타 액의 양 (mL)의 비율으로 결과 표현 / 몸 무게 (g) 마우스.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

타 액 생산은 복잡 한 프로세스 이며 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 실험실 동물에 침 샘 기능을 측정 하는 것은 도전 될 수 있습니다. 추가 도전 침 샘 기능 같은 동물에서의 반복된 측정은 질병의 발병을 설정 하거나 복구 치료 다음과 설명 필요입니다.
이 보고서에 설명 된 면봉 메서드는 데이터를 표현 하기 위해 여러 옵션을 수행할 수 기술적으로 간단 하다. ?...

침 샘 침 다양 한 신경 및 기계적 자극1에 대 한 응답을 생성합니다. 자극에 선 아드레날린 및 해 수용 체 교감 및 부 교감 신경 신경 시스템을 통해 수행 됩니다. Pilocarpine muscarinic 수용 체에 우위 하 게 작동 해, 파라 sympathomimetic 에이전트입니다. 침 샘에 그것은1M3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체에 행동에 의해 타 액의 생산을 유도합니다. Pilocarpine 관리에 따라 타 액 생산 자극에 응답 하는 침 샘의 능력의 지표 이며 침 샘 기능의 측정으로 상용 된다.
타 액 생산의 정확한 측정은 Sjögren의 증후군2 등 방사선 상해 다음 머리와 목 암 치료3침 샘 질환의 연구에 중요 합니다. 여러 가지 다른 방법은 설치류에 타 액 생산을 측정 하기 위해 개발 되었습니다. 4배설 침 덕트, 진공5, 아래 구강에서 타 액의 수집 그리고 유리 모 세관6 또는 micropipette7,8, 를 사용 하 여 컬렉션의 직접적인 cannulation 포함 됩니다. 9. 직접 cannulation 침 덕트의 가장 정확 하 고 순수한 타 액을 제공 합니다. 그러나, 이것은 기술적으로 도전적인 절차, 그리고 ductal 상해를 일으키는 원인이 되기를 위한 잠재력 같은 동물에서 반복적인 침 컬렉션 걸로 하겠습니다. 진공에서 타 액을 수집 튜브에서 타 액의 건조 변수 결과 발생할 수 있습니다. 이 감소는 감소 된 타 액 분 비와 쥐에 더 과장 된다. 그러나 유리 모 세관 후속 분석을 위해 타 액의 컬렉션, 병에 걸린 상태에서 분 비 하는 타 액의 점도 변화는 모 세관의 효율적인 충전을 방지 하는. 또한, 잔여 타 액을 수집 구강 청소 하려고 부상으로 이어질 수 있습니다. 피펫으로 메서드는, 완전 한 컬렉션에 대 한 수 있습니다 하 고 같은 연산자에 대 한 그것은 눈에 띄게 실험 사이. 그러나, 알 수 없는 이유로이 방법은 다른 연산자 사이의 중요 한 변화를 보여줍니다. 따라서, 적절 한 비교를 허용 하려면 동일한 연산자는 특정 프로젝트와 관련 된 모든 실험을 수행 필수적 된다. 명확 하 게,이 실험실을 위한 중요 한 불리를 나타냅니다.
이러한 문제를 해결 하려면 프로시저 결합 타 액 수집 방법 인간과 설치류에 대 한 사용 개발 되었다. Pilocarpine 유도 침 볼륨 측정에 대 한 아래 설명 하는 면봉 방법을 간단 하 고, 재현성, 연산자에 의해 영향을 받지 이며 같은 동물에 반복적으로 수행할 수 있습니다. 또한, 단백질, 면역 글로불린, 또는 다른 생체의 후속 분석을 위해 타 액을 수집 하는 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthesia Mix solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td><td>RXANASED-20</td><td>Stock is 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Isotonic sterile saline</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Used as diluent</td></tr><tr><td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td><td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td><td>48272</td><td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Children&#039;s swab</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Individually wrapped swabs</td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tubes</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge regular bevel needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blade #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&quot; length</td></tr><tr><td>Label tape</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>3 channel timer</td><td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adjuvant</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td><td>Generated in lab</td><td></td><td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ Kits for saliva analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary lysozyme estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td><td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary IgA estimation by sandwich ELISA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgA</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary protein estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>BioRad, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>For protein estimation as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr></tbody></table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

Sjögren의 증후군, 전 분 비에 영향을 미치는 면역 질환 환자는 침 샘 염증을 개발 하 고 타 액 생산을 감소 했습니다. 마찬가지로 타 액 생산 머리와 목 암에 대 한 방사선 치료를 받은 환자에서 심각 하 게 손상 됩니다. 설치류 모델, 이러한 임상 조건 모방 개발 질병 pathogenesis의 이해를 촉진 하 고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 허용. 따라서, 정확 하 게, reproducibly, 그리고 반복적으로 동물 모델에서 침 샘 기능을 측정 하는 능력은 중요 합니다. 문학에서 설명한 이전 절차에 건물, 메서드는 이러한 기준을 충족 하 고 쥐에 있는 침 샘 기능을 평가 하는 데 사용 했다 개발 되었다. 이 새로운 방법의 추가적인 이점은 그것 쉽게 마스터 하 고는 작은 간 연산자 변화입니다. 침 샘 기능 (무게 또는 양) 또는 pilocarpine 자극에 대 한 응답에서 생산 하는 타 액의 속도 (mL/min)로 평가 됩니다. 수집 된 타 액 단백질 콘텐츠, 면역 글로불린 농도, 및 다른 생체 분석에 대 한 좋은 소스입니다.

실험 마우스 모델 시스템에서 응답 pilocarpine 자극으로 타 액을 생산 하는 능력은 침 샘 기능의 지표로 서 사용 됩니다. 타 액 생산 면봉 메서드에서 11 주 된 C57BL/6 여성 쥐에서 측정 했다. 그림 1A, 결과 타 액 (mg) 수집된 pilocarpine의 증가 복용량을 다음의 금액으로 표시 됩니다. 체중 1 mg/kg의 복용량에 쥐의 일부 (무의식적인 떨고 고 떨고) 조 난 전시 시?...

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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

쥐에 있는 침 샘 기능의 측정 하는 방법

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

a-method-for-the-measurement-of-salivary-gland-function-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.6K 조회수.  Oklahoma Medical Research Foundation. 침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

비디오: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 Cannulation

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

연구

의학

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

생물학

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

면역학 및 감염병학

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Pilocarpine 자극 다음 통해 murine 침 기능 평가 분류 한 방사선

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

마우스 턱밑샘 재생의 실시간 실시간 이미징

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

저자 스포트라이트: Studying Macrophage-Epithelial Cell Interactions in Salivary Gland Regeneration After Injury(부상 후 타액선 재생에서 대식세포-상피세포 상호작용 연구) 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

쥐에 있는 침 샘 기능의 측정 하는 방법

요약

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Pilocarpine 자극 다음 통해 murine 침 기능 평가 분류 한 방사선

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사