Name: a method for the measurement of salivary gland function in mice
Uploaded: 2018-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
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研究は、国立衛生研究所、国立歯科頭蓋顔面研究 (DE025030) からの助成金によって支えられました。

下記プロトコルは機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、健康の国民の協会によって倫理的なガイドラインに従うこと。このレポートに表示されるすべてのデータは、10-12 週齢をした雌のマウスを使用して生成されました。マウスの次の系統が使用された: (B6XA/J) F1、129S、DBA1 BALB/c C57BL/6。すべてのマウスが特定病原体フリーの条件でバリア ケージ (檻ごと 5 動物) に収容され、飼料と水のアドリブ。
1. 準備
<ol><li>塩酸ピロカルピンの原液を準備するには、化合物の 10 mg の重量を量るし、ボルテックス 5.63 mg/mL の原液を与えることによって 1.776 mL 滅菌等張生理食塩水に溶かします。このソリューションを消毒する必要はありません。しかし、必要な場合は、0.2 μ M フィルターをフィルター処理します。3 ヶ月間-80 oC の冷凍庫に複数の因数でこの原液を格納します。各冷凍ストックは、1 つ使用します。解凍後、ピロカルピン ソリューションは再冷凍しないでください。</li>
	<li>0.6 mL の microfuge の管と温水 18 ゲージ針で慎重に各チューブの底に小さな穴をパンチします。2 mL の管にこれらの管を設定しました。チューブを滅菌する必要はありません。</li>
	<li>長さ約 2 cm の部分に円筒吸収性の綿棒をカット、シャープ、滅菌かみそりの刃を使用しています。斜めに 2 の円錐形をした綿棒を与える各 2 cm 部分をカットします。0.6 mL の microfuge の管のそれぞれに 1 つの綿棒を配置します。</li>
	<li>乾燥綿棒を含む 0.6 mL および microfuge の管の重量を量る。</li>
	<li>水のボトルと新しいきれいなケージに調査されるマウスを転送します。収集唾液の汚染から食品の粒子を防ぐために唾コレクションの開始前に少なくとも 2 時間の食べ物がなくてもマウスを維持します。 注: この手順のケージごと 1 マウスを維持する必要はありません。ただし、各ケージに置かれたマウスの数は特定の学校の規則の動物の使用のための規則に依存します。</li>
	<li>2 h の終わりの直前に滅菌生理食塩水で原液の 100 倍希釈することによって作業ピロカルピン液 (0.0563 mg/mL) を準備します。さらにフィルターする必要はありませんこのソリューションを滅菌します。氷上作業ピロカルピン ソリューションを常に保ちます。 注:表 1はピロカルピン体重 0.375 mg/kg の最終的な線量を与えるマウスの体重の範囲に注入する量を示します。</li>
</ol>2. 手続き
<ol><li>各マウスの重さし、表 1を使用して各マウスの麻酔のミックスの用量を決定します。麻酔のミックスの適切なボリュームと腹腔内のルートで最初のマウスを注入します。(ほとんどのマウス系統をこのプロトコルでテストは 2 分でスリープ状態に入る) 2 分間タイマーを設定します。マウスの麻酔正しく平らな面に置いたときの歩行の不足を確認します。マウスがまだ歩いている場合、は、次のステップに進む前にさらに 2 分を待ちます。乾燥を防ぐために両方の目に潤滑剤の眼軟膏のドロップを適用されます。 注:テーブル 1、麻酔のミックスの投与量 0.007 mL/g 体重です。この手順に最適な範囲に 0.008 0.006 mL/g 体重。しかし後に、4 分、マウスがまだ歩くかぎくしゃくした動きを示す場合適切に麻酔薬の投与量を増加させるため機関の獣医師と相談して。</li>
	<li>表 1を使用してマウスのピロカルピンの投与量の決定し、適切な量を注入して腹腔内のルート。2 分間タイマーを設定、切断端から頭と耳を出すまで、マウスを 50 mL 落管に挿入します。頭を下げ、45 度の角度で管と上向き腹側表面を配置します。移動からそれを維持する手順ボードにチューブをテープします。 注:表 1は、17 g 以下の重量を量るマウスにこの手順が試行されていないように 17 g 以上のマウスの投与量を提供します。</li>
	<li>2 分の最後に、優しくマイクロ鉗子を口の中に解離性の閉じたペアを挿入する、上向きに口を開くに下顎を持ち上げます。さらに 1-2 mm の鉗子を舌が鉗子のトップの腕に休息を見られることを確かめて、口の中に押し込みます。微細鉗子の別のペアに円錐形の先端に近い重量を量られた事前乾燥綿棒を保持します。</li>
	<li>口に綿棒の円錐形の先端をゆっくり押し込みます。口腔内に綿棒の先端を残しながら鉗子を撤回します。</li>
	<li>広い口の外を拡張する綿棒の端をつかみ、口が付いている接触の最大の領域を許可するように回します。綿棒を 15 分間この位置にしてください。 注: コレクションの期間の綿棒が口の中に残っているとこうなります。綿棒の円錐形の先端が芯として機能、綿棒の広い部分は口の外に注意してください。</li>
	<li>15 分の終わりには、ゆっくり吸収されていない唾液を収集するには綿棒を回転させると、湿式の綿棒に 0.6 mL および microfuge の管。管を閉じて、氷上に置いた 2 mL チューブでそれを設定します。 注: この時、口腔粘膜が完全に乾燥で表示されます。今、マウスも、麻酔からの回復のためのケージに戻って移動することができます。</li>
	<li>ケージ内マウスを転送します。場所は、高速な再水和作用を助けるために唾液収集後ケージに餌ペレットを湿らせた。 注: マウスは、コレクションの終了後 10 分以内で目覚めます。0.2 mL に予め温めておいた等張生理食塩水の皮下注入は、回復を加速に与えられる可能性があります。</li>
	<li>次のマウスに進みます。すべての彼らが完全に回復するまで、マウスを監視する必要があり、外来。</li>
</ol>3. 測定
<ol><li>すべてのコレクションの最後に、ウェット綿棒と 0.6 mL の管の重量を量る。湿重量と唾液が生産の重量を得るための乾燥重量の差を計算します。2 mL チューブに唾液で 0.6 mL のチューブを配置します。</li>
	<li>2 ml チューブのキャップを切った。その後、唾液を回復するマイクロ遠心分離機で 4oC で 7500 x g で 2 分間 2 mL チューブを遠心分離機します。マイクロ ピペットを用いて唾液の量を測定します。</li>
	<li>唾重量 (mg)10 15 分以上、または唾重量 (mg) の比として結果を表現/体重 (g) をマウスします。 注: 綿棒から抽出の唾液の量を測定すると、唾液の回復 (mL) のボリュームまたは唾液の量 (mL) の比として結果を表現/体重 (g) をマウスします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+salivary+secretion.">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li><li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome.">Sj&#246;gren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li><li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device.">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li><li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren's+syndrome.">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li><li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function.">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li><li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disease+in+(NZB+x+NZW)F1+mice.">Inflammatory stimuli accelerate Sj&#246;gren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disorder+in+mice.">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sj&#246;gren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li><li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca J&#250;nior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation.">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice.">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li><li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow.">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li><li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine:+teaching+an+old+drug+new+tricks.">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li><li>Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saliva+collection+using+cotton+swab+on+cortisol+enzyme+immunoassay.">Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay.</a> Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

唾液の分泌は複雑なプロセスであり、多くの要因に影響されます。したがって、測定実験動物の唾液腺機能は、挑戦をすることができます。追加の課題は、同じ動物の唾液腺機能の繰り返し測定が病気の発症を確立する次の治療回復を示す、または必要なことです。
このレポートで説明した綿棒方法は技術的にデータを表す複数のオプションを実行する簡単です。得られる結果は、事業者間の変動が小さいと、再生可能です。メソッドは、唾液腺機能不全の異なるモデルの唾液の分泌の減少を検出できます。重要な利点は不活性、高吸水性ポリマーの使用と唾液の測定を許可する収集、唾の効率的回収。このメソッドのもう一つの利点は、単一の演算子を一度に最大 2 マウスで同時にこの手順を実行することが可能です。これは同時に単一のマウスで舞われることいくつかの他の方法よりも大幅に効率化です。
唾生産測定の変動はすべて唾液測定技術の悩みの種にされています。変動を最小限に抑えるため、プロトコルに厳密に準拠することが重要です。重要な手順が含まれます: 乾式と湿式の綿棒の正確な重量記録とピロカルピン (表 1)、麻酔薬の投与の適切なマウスを断食と唾液を収集の日の同じ時間を選択します。設定 2 マウスまで唾コレクションの時に慎重な時間管理が必要です。
図 3に示すとおり、マウスによって生成される唾液の量はひずみ依存です。したがって、適切なひずみ、年齢及び性別コントロールとして一致するマウスを使用する必要があります。ピロカルピン投与量、特定のひずみと調べ、実験条件のための滴定することを強くお勧めします。0.5 mg/kg を超えてピロカルピンの高用量は、唾液腺の機能低下を評価するための増産を誘導する、低用量を使用することをお勧めします。これにより、唾液の分泌、病気の間にも若干の違いを識別するため、マウスを制御します。0.5 mg/kg 体重と 0.375 mg/kg 体重の投与量は、唾液腺機能低下を示す正常に使用されてが。ただし、特定実験システムはこのプロトコルで記述されているよりもコレクションの短いまたは長い期間を必要があります。これは、各研究室でテストする必要があります。
このメソッドとほとんど唾液測定方法の制限は、麻酔の必要性です。真空によるレポートでは、麻酔5の使用は含まれません。ただし、麻酔がない場合は、マウスの不安のさまざまなレベルを誘導します。彼らは闘争し、チューブを噛まないようにする傾向があるし、唾液の出力とコレクションの効率に影響を与えます。イソフルラン麻酔ラットでは、ドロップイン ピロカルピン誘導唾液生産12を誘導します。対照的に、ケタミン交感神経刺激13を介して気管支や唾液中の分泌物が増加します。私たちと他の人が正常に、ケタミンを使用、ピロカルピンを測定するため麻酔薬としてキシラジン混合物による唾液生産4,7,8,9。外科麻酔の推奨範囲はケタミンの 100-200 mg/kg、5-16 mg/kg キシラジン14。0.006 0.008 量 mL/g 体重 (ケタミンの 60-80 mg/kg とキシラジンの 6-8 mg/kg に相当します) このメソッドで使用される推奨範囲の下端に落ちるし、深い麻酔なし固定の一貫したレベルを提供するだけで十分です.
綿棒法は、日常的に使用される micropipet メソッドに代わるものとして設立されました。ピペット法の主要な不利な点は高いオペレーター間変動と同時に 1 つのマウスから唾液を収集する必要性だった。綿棒法は、これらの問題を解決します。利点統計分析と効率性の向上に力を達成するために必要な動物の数を制限することがあります。不活性ポリマー綿棒と交換の綿棒は、綿棒、生理活性分子15の定量に影響を与える知られているのでより良いオプションを提供しています。
綿棒法の異なる個人間の再現性の高いシンプルさを考えると、綿棒法が異なる研究室で研究者と機関のマウス モデルのよりよい比較を容易に望まれます。

唾液腺は、様々 な神経学的および力学的刺激1に対して唾を生成します。刺激は、腺のアドレナリン作動性およびコリン作動性受容体に交感神経と副交感神経の神経系を介して実行されます。ピロカルピンは、ムスカリン受容体に作用する主にコリン作動性、パラ交感神経エージェントです。唾液腺には、M31ムスカリン性アセチルコリン受容体に作用して唾液の生産を誘発します。ピロカルピン投与唾液の分泌唾液腺の刺激に応答する能力の指標であるし、唾液腺の機能の尺度として使用されます。
シェーグレン症候群2頭頸部がん治療3放射線障害などの唾液腺疾患における唾液の生産の正確な測定が欠かせません。齧歯動物の唾液の分泌を測定するさまざまな方法が開発されています。排泄の唾液腺導管4、5真空下で口腔内から唾液のコレクション、ガラス毛細管6またはピペット7,8,を使用して、コレクションの直接穿刺が含まれます9. 直接唾液腺導管の穿刺が最も正確かつ純粋な唾を提供します。ただし、これは技術的に挑戦的な手順、管の損傷を引き起こす可能性を排除する同じ動物から反復唾液コレクション。真空下で唾液を収集管から唾液の乾燥により、変数の結果につながることができます。この損失は、減らされた唾液を持つマウスでさらに誇張されています。ただし、病気の状態で分泌される唾液の粘度の変化により、毛細血管の効率的な充填、ガラス管許可以降の解析のための唾液のコレクション。さらに、残留唾液を収集するために口腔内を掃除しようは、怪我につながることができます。ピペット法は、完全なコレクションと同じ演算子の実験間非常に一貫しています。しかし、未知の理由のためこのメソッドは差の異なる演算子を示しています。したがって、適切に比較できるように、同じ演算子は、特定のプロジェクトに関連するすべての実験を実行することが不可欠なります。明らかに、これは実験室の主要な不利な点を表します。
これらの問題を克服するためにプロシージャを組み合わせた唾コレクション メソッドを人間および齧歯動物の使用をしました。ピロカルピン誘導唾液量を測定するため下記綿棒の方法は、簡単に再現できる、オペレーターによって影響されないと同じ動物で繰り返し実行することができます。さらに、タンパク質や他の生体分子、免疫グロブリン、以降の解析に唾液を収集できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthesia Mix solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td><td>RXANASED-20</td><td>Stock is 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Isotonic sterile saline</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Used as diluent</td></tr><tr><td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td><td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td><td>48272</td><td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Children&#039;s swab</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Individually wrapped swabs</td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tubes</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge regular bevel needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blade #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&quot; length</td></tr><tr><td>Label tape</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>3 channel timer</td><td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adjuvant</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td><td>Generated in lab</td><td></td><td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ Kits for saliva analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary lysozyme estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td><td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary IgA estimation by sandwich ELISA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgA</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary protein estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>BioRad, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>For protein estimation as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr></tbody></table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

外分泌腺に影響を与える自己免疫疾患シェーグレン症候群患者唾液腺の炎症を起こすし、唾液の生産を減らした。同様に、唾液の分泌は、頭頸部がんの放射線治療を受けている患者の侵害が深刻です。齧歯動物モデル、これらの臨床条件を模倣するために開発は疾患の病態の理解を容易にして新しい治療戦略の開発を可能にします。したがって、正確に、再現性をもって、繰り返し動物モデルで唾液腺の機能を測定する能力は重要です。以前文献で説明されている手順を踏まえ、方法はこれらの基準を満たしているとマウスの唾液腺機能の評価に使用されたを開発しました。この新しいメソッドの追加の利点は、それが簡単に習得し、そしてオペレーター間の変動が小さいをことです。唾液腺機能は、数量 (重量又は容積) または唾液ピロカルピン刺激に反応して生成率 (mL/分) として評価されます。採取唾液タンパク質含有量、免疫グロブリン濃度と他の生体分子の解析のためのよい源であります。

実験的マウス モデル システムにおけるピロカルピン刺激への応答の唾液を生産する能力、唾液腺機能の指標として使用されます。唾液の分泌は、綿棒法による 11 週齢の c57bl/6 雌マウスで測定しました。図 1 aで結果は唾液 (mg) 収集したピロカルピンの用量増加を次の量として表されます。1 mg/kg 体重の投与量でマウスのいくつかで遭難 (不本意な揺れと震え) の展示を開始しました。したがってピロカルピン 1 mg/kg 体重以上の高用量は、本研究ではテストしませんでした。図 1 b結果は、マウスの体重 (g) 唾重量 (mg) の比率として表されます。総称して、これらのデータは、ピロカルピンの量や唾液の生産の良い線量反応関係を表示します。綿棒から回復した唾液の量を測定したも。図 1に示すように、唾重量と唾液の 1 mg が 0.001 mL を等しい容積と重要な索引があります。
綿棒法により得られた結果は、ピペットのコレクション メソッドで得られるものに似ています。図 2 aは、綿棒法とピペット法によって収集された唾液の平均量は非常に似たような違いが統計的に有意であることを示しています。図 2B2 C 、 2 D表示綿棒メソッドは唾液中の生体分子の推定に影響しませんでした。実際には、ピペット法と比較して綿棒法は平均レベルの総唾液蛋白 (図 2)、唾液リゾチーム (2 D 図) (図 2 e) 唾液 IgA の全体的に高い傾向を示した。ただし、これらの違い有意な。
ここで説明した唾コレクション メソッドが異なるマウス系統 (図 3) によって生成される唾液や別の病気の条件 (図 4) による唾液腺機能の違いを検出することができます。図 3 aは、10-12 週齢雌 129S6 DBA1/J、balb/c C57BL/6 マウスからピロカルピンによる唾液の分泌の結果を示しています。129S6 マウスは、他の系統と比較して唾液の最低の量を生産しました。これらのマウスの体重に差はなかった大幅に異なる (図 3 b) ことに注意してください。次に、綿棒法は唾液腺機能低下を検出する使用され、2 つの例は、図 4に示します。図 4 aは、リポ多糖 (LPS) の注入に続く自然免疫活性化による唾液腺機能低下の代表的な結果を示しています (10 μ g/マウス、腹腔内)。11生理食塩水を注入したコントロール マウス。LPS 投与マウスは、コントロールと比較して唾液中の大幅な低下を示します。シェーグレン症候群抗原 A と反応抗体の受身伝達/Ro52 は、唾液腺機能低下を誘導する、このモデルはシェーグレン症候群9の特定の側面を模倣します。マウス注入アジュバント ミョウバンを図 4 bに示すとおり、プラス未処理マウスと比較して有意に低い唾液の生産を一緒にしていた抗 Ro52 抗体またはミョウバンでのみ扱われるマウス。
綿棒法は独立したオペレーターと実装する簡単です。図 5は、実験 2 の異なる演算子で 6 の異なる時点で実行される、10-13 週齢女性 c57bl/6 マウスから唾液の生産を示しています。演算子演算子 II 業務経験、以前のマウスの 6 ヶ月を持っていたが、1 週間唾コレクション メソッドにだけ導入された経験を処理マウスの 2 ヶ月のみ始めました。これらのデータは、ほぼ 1 年離れて、ピロカルピン 0.375 mg/kg を使用して行う実験で生成されました。両方の演算子によって得られる唾液の比率は、(1.84 に 5.87) の測定値の範囲を示します。演算子演算子 II 実験以上に 3 日連続ほぼ 1 年後 (図 5 a) を行ったときの実験 10 週間の期間を指します。特に、時間をかけて得られる唾液比大幅に差は認められなかった (p = 0.064;Kruskal-Wallis テスト)。オペレーター間のバリエーションをさらに比較するには、各演算子に対して 3 実験から g 体重あたりの唾重量の比は物をプールし、図 5Bに示します。唾比が取得者 (平均 + SEM; 4.45 + 0.152、n = 38) 演算子 2 から有意な差がない (平均 + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 マン ホイットニー テスト)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig1.jpg"> 図 1: 唾液の分泌はピロカルピン投与量に依存しています。ピロカルピン (0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg 体重) の異なる投与量を注入した C57BL6/J マウス (11 週齢雌、5 グループごと)、15 分(A)の唾液の分泌を測定した結果、mg 唾液量 (平均 ± SEM) として表されます。(B)データは、平均唾比 (g マウス体重あたりの mg 唾液) として表されます。11 週齢女性 c57bl/6 マウスの(C)唾液 (n = 5) 綿棒による採取します。ピロカルピンは、0.375 mg/kg 体重の投与量で使用されました。濡れた綿棒は mg で生産する唾液の量を測定する重量を量った。綿棒で唾だった遠心分離、によって回復し、回復した唾液の量を測定しました。Μ L で mg や唾液量の唾重量間重要な契約に見られる<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57203/57203fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig2.jpg"> 図 2: 綿棒メソッドに唾液中の生体分子の解析は影響しません。11 週齢女性の c57bl/6 マウスの 2 つのグループから唾 (n = グループあたり 5 マウス)、綿棒メソッドまたは micropipet メソッドによって収集されました。唾 (A)、タンパク質 (B) の平均額平均ボリュームの違いとリゾチーム (C) の金額は、2 グループ間の IgA の量は重要ではない統計的に意味します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57203/57203fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig3.jpg"> 図 3: 唾コレクションの綿棒メソッドは、マウスの異なった緊張によってベース ライン唾液の生産の違いを検出します。(A)女性 (10 12 週齢) マウスの唾液は、0.375 mg/kg 体重のピロカルピンの投与量を使用して 15 分の収集されました。(B)マウスのグループ間の平均体重は大幅に異なるでした。統計的有意性を分析クラスカル-ウォリス ダンに続いてテストの複数の比較テスト。P < 0.05 が重要と考えられていた。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57203/57203fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig4.jpg"> 図 4: 綿棒メソッドは唾液腺機能低下を検出します。(A) (B6 X A/J) F1 雌マウスがいずれかの組合のソリューションを注入した (0.1 mg/mL、0.1 mL あたりマウス腹腔内) または生理食塩水や唾液は 26 h を測定した後。代表的な実験を示す重要な (p = 0.0079) LPS と扱われるマウスの唾液の分泌の低下 (60%)。(B)唾液腺機能低下は、シェーグレン症候群の実験的マウス モデル システムで測定しました。腺機能不全の誘導の以前に発行されたパッシブ転送モデルは、いくつかの変更で使用される4だった。女性の c57bl/6 マウス (10-12 週齢) は、ミョウバン アジュバントを注入しました。日 14 〜 20 マウスはウサギ抗 Ro52 血清の 0.05 mL を注入したし、唾液の分泌は、24 時間に重要な注意してください後測定した (p = 0.0003) ミョウバンと抗 Ro52 血清と扱われるマウスの唾液の分泌の減少 (50%)。統計的有意性を分析クラスカル-ウォリス ダンに続いてテストの複数の比較テスト。P < 0.05 が重要と考えられていた。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57203/57203fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig5.jpg"> 図 5: (A) と (B) のオペレーターの間時間をかけて綿棒の方法で再現性のある結果が得られます。綿棒法は、マウス実験の結果, 1 年以上の経験を処理の異なる長さの 2 つの演算子の間のと同等の結果を示しています。C57BL/6 雌ネズミ (10-13 週齢) のベースライン唾液の生産は、それぞれの演算子によって測定しました。結果は、唾液の生産 (mg/g 体重) の重量として表されます。唾コレクションの日付が x 軸に、時間をかけて収集されたデータから結果を示す(A).各データ ポイントを表す 1 つのマウスとマウスの各時に解析され数がかっこで表示されます。3 実験からプール基準唾率 (平均 + SEM) (B)のとおりし、演算子の間に有意な差がないです。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57203/57203fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

唾液腺機能低下は自己免疫病と放射線療法の頻繁に結果です。これらの疾患のマウスモデルにおける唾液腺機能の再現性の評価は、技術的な挑戦です。ここでは、マウスの唾液の分泌の正確かつ再現可能な測定のための簡単な方法を説明します。

マウスの唾液腺機能の測定法

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K ビュー.  Oklahoma Medical Research Foundation. 唾液腺機能低下は自己免疫病と放射線療法の頻繁に結果です。これらの疾患のマウスモデルにおける唾液腺機能の再現性の評価は、技術的な挑戦です。ここでは、マウスの唾液の分泌の正確かつ再現可能な測定のための簡単な方法を説明します。

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Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

ワルトン管を経由してマウス顎下唾液腺のカニュレーション

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

医学

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

マウス唾液腺幹細胞の単離

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

生物学

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

免疫・感染学

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

マウス顎下腺再生のリアルタイムライブイメージング

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

著者スポットライト:損傷後の唾液腺再生におけるマクロファージ-上皮細胞相互作用の研究 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

マウスの唾液腺機能の測定法

要約

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マウス唾液腺幹細胞の単離

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蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)