Este protocolo describe dos estrategias de suplementación lipídica con una combinación de análisis longitudinal y transcripcional en el organismo modelo, C.elegans. La técnica describe cómo examinar los cambios transcripcionales utilizando pocos gusanos o tejidos de gusanos disecados y cómo la alimentación líquida para una población de insectos podría combinarse con técnicas hidráulicas. Las personas que realizan esta técnica deben practicar la disección de tejidos debido a la corta ventana de tiempo para realizar el experimento para lograr un análisis transcripcional adecuado.
Para comenzar, recolecte la bacteria OP50 centrifugando el cultivo cultivado durante la noche a 4, 000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Suspender el pellet bacteriano en 20 mililitros de dilución bacteriana, restricción dietética o base BDR por vórtice y nuevamente, repetir la centrifugación durante 10 minutos.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en el medio BDR para preparar un stock bacteriano 20 X BDR. Diluir el stock bacteriano a 5X usando un medio BDR antes de usarlo. Usando etanol o sulfóxido de dimetilo como solvente, prepare una solución de reserva lipídica en un nuevo vial de vidrio esterilizado en autoclave y llene el vial de vidrio con argón o nitrógeno para evitar la oxidación.
Transfiera la solución de reserva lipídica a la solución de bacterias BDR para lograr la concentración final deseada en condiciones de alimentación. Mezclar bien mediante vórtice durante 20 segundos. Preparar el vehículo controlado mezclando los mismos volúmenes de etanol filtrado o dimetilsulfóxido con bacterias BDR.
Realice la suplementación de lípidos y el cultivo líquido transfiriendo la cantidad deseada de control de lípidos o vehículos a cada pocillo de una placa de 12 pocillos con tres o cuatro réplicas para cada condición de alimentación. Mezcle la suspensión sincronizada de gusanos Caenorrhabditis elegans con bacterias 5X BDR en una proporción de uno a uno para lograr una concentración final de 1, 500 gusanos por mililitro y 2.5X para bacterias. Luego transfiera dos mililitros de la mezcla de bacterias del gusano a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
Cuando haya terminado, envuelva la placa de 12 pocillos con papel de aluminio y agite la placa en una incubadora de 20 grados centígrados a 100 RPMM para obtener la longitud de incubación deseada. Para la suplementación de lípidos en placas, siembre un mililitro de las bacterias condicionadas por lípidos en el centro de un medio de crecimiento de nematodos de 10 centímetros o placa de agar NGM. Asegúrese de que la solución de trabajo final se mueva varias veces entre la siembra de las dos placas cuando trabaje con un gran número de placas.
Seque la placa en la oscuridad dentro de una campana de bioseguridad. Transfiera 3000 gusanos del cultivo de gusanos sincronizado a la placa de 10 centímetros. Seque la placa en una campana de bioseguridad hasta que los gusanos que nadaban en las placas suplementadas con lípidos comiencen a gatear.
Una vez seca, incubar la placa acondicionada con lípidos en una incubadora de 20 grados centígrados durante el tiempo deseado y, si usa lípidos poliinsaturados, proteja la placa de la luz. Prepare 20 microlitros de solución de lisis final para cada muestra mezclando 0,2 microlitros de DNasa I con 19,8 microlitros de solución de lisis en un tubo de PCR y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Para extraer el ARN del pequeño número de gusanos enteros, elimine las bacterias transfiriendo de 15 a 20 gusanos del césped bacteriano a una placa NGM recién sin sembrar.
Transfiera de 15 a 20 gusanos de la placa NGM sin sembrar al tubo de PCR que contiene 20 microlitros de la solución de lisis final recién preparada con el número mínimo de bacterias e incube la reacción de lisis durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, mantenga la muestra en un buen baño de agua fría y sonice sonicar los gusanos cuatro veces, cinco segundos cada vez con 30% de amplitud y pulso durante 15 segundos entre cada momento de sonicación. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de agregar dos microlitros de solución de parada en la reacción de lisis y mezclar con golpeteo suave.
Incubar la reacción durante dos minutos a temperatura ambiente y luego colocar el tubo en hielo. Para extraer el ARN del tejido del gusano, recoja alrededor de 20 gusanos del césped bacteriano y colóquelos en una placa NGM fresca sin semillas para eliminar las bacterias de los gusanos. Transfiera 20 gusanos con la menor cantidad posible de bacterias a un vidrio de reloj que contenga 500 microlitros de solución M9 que contenga cuatro levamisoles micromolares.
Cuando los gusanos estén inmovilizados, diseccionar la línea germinal o el intestino con una aguja de calibre 25 que se puede conectar a la jeringa de un mililitro. Usando una pipeta de vidrio esterilizada en autoclave, transfiera los tejidos disecados al tubo de PCR y coloque el tubo en hielo durante dos minutos permitiendo la deposición del material en la parte inferior. Retire el sobrenadante del tubo de PCR antes de agregar 20 microlitros de solución de lisis final y mezcle bien golpeando.
Después de incubar la reacción de lisis durante cinco minutos, agregue dos microlitros de solución de parada y golpee el tubo varias veces. Incubar el tubo durante dos minutos antes de proceder a la transcripción inversa. En el estudio de validación, el ARN extraído de una gran población y unos pocos gusanos mostraron una inducción similar de los genes de procesamiento de neuropéptidos, egl-3 y egl-21.
Sugiere que la extracción de ARN de unos pocos gusanos puede ser una alternativa válida a las técnicas estándar de síntesis de CDNA de grandes poblaciones. En el intestino diseccionado de los gusanos transgénicos lipl-4, suplementado con ácido dihomo-gamma-linolénico, o DGLA, no se indujeron los genes de procesamiento de neuropéptidos neuronales. La suplementación con DGLA a diferentes concentraciones rescató la extensión de la vida útil en los gusanos tras la eliminación de grasa-3.
Los gusanos con suplementos lipídicos también pueden procesarse para secuenciación de ARN, proteómica, metabolómica y estudios de comportamiento para identificar fenotipos adicionales bajo estas condiciones específicas. Esta metodología se puede aplicar a la investigación del envejecimiento, la biología de los lípidos y cualquier otra área de investigación que tenga como objetivo establecer una relación entre un determinado fenotipo y un factor nutricional o metabolito.
