Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de los mecanismos de convulsiones, tales como, qué subpoblaciones neuronales son responsables de la aparición y terminación de convulsiones electrográficas. La principal ventaja de esta técnica, es que puede reproducir eventos de convulsiones electrográficas, bajo demanda, y modelos in vivo e in vitro que recuerdan a los observados clínicamente. Esta técnica también se puede utilizar para buscar posibles terapias anticonvulsivas, intentando desencadenar eventos de convulsiones electrográficas durante la aplicación de diferentes candidatos a fármacos anticonvulsivos.
Para preparar las rodajas corticales, pegue el tejido cerebral preclínico en la etapa de Vibratome, utilizando pegamento adhesivo instantáneo. Coloque suavemente el soporte de especimin en la bandeja del tampón. Asegurar que la parte dorsal del cerebro está frente a la hoja del Vibratome.
Corta el cerebro en secciones de 450 micrómetros de espesor, en la dirección dorsal a ventral. Haga el primer corte en el cerebro animal preclínico para eliminar la bombilla olfativa. A continuación, realice cortes posteriores hasta que se observe el área del motor somatosensorial.
Utilice una pipeta de diámetro ancho. Transfiera las rodajas coronales dirigidas a un plato de Petrie que contenga solución de disección en frío. Para las rodajas coronales, haga un corte transversal justo debajo de la comisura neo cortical, y luego, corte en la línea media para separar los hemisferios.
Luego, usa una nueva cuchilla de afeitar para cortar cualquier exceso de tejido de las rodajas. Es fundamental realizar el procedimiento de corte cerebral de manera eficiente. Cada momento el tejido cerebral no está sumergido en ACSF, es perjudicial para su calidad.
El tejido cerebral dañado y de mala calidad es menos propenso a generar eventos de convulsiones electrográficas. Transfiera la porción dorsal de las rodajas coronales, que contienen la neo corteza, a un segundo plato petrie lleno de 35 grados Celsius ACSF, por un momento. A continuación, transfiera rápidamente las rodajas a una cámara de incubación, que contiene 35 grados Celsius carbogenado ACSF.
Deje las rebanadas cerebrales ligeramente sumergidas en la cámara de incubación a 35 grados celsius durante 30 minutos. A continuación, retire la cámara de incubación del baño de agua y deje que vuelva a la temperatura ambiente. Espere una hora a que las rebanadas cerebrales se recuperen antes de realizar grabaciones electrofisiológicas.
En este procedimiento, corte el papel de la lente que es ligeramente más grande que la rebanada del cerebro. Utilice una pipeta de diámetro ancho o un cepillo de detalle para transferir una rebanada de cerebro al papel de la lente recortada que se mantiene en su lugar usando una pinza dental. Luego, transfiera el papel de la lente con una rebanada cerebral a la cámara de grabación y fíjelo en su posición con una pantalla de arpa.
Posteriormente, profusa la rebanada cerebral en la cámara de grabación con ACSF carbógeno a 35 grados Celsius a una velocidad de tres mililitros por minuto. Utilice un termómetro digital para asegurarse de que la cámara de grabación es de 33 a 36 grados centígrados. A continuación, rellene los electrodos de vidrio con 10 microlitros de ACSF, utilizando una jeringa Hamilton.
Bajo el estereomicroscopio 20 veces, guía el electrodo de vidrio de grabación en la capa cortical superficial, dos, tres, usando manipuladores manuales. Vea la actividad eléctrica de la rebanada cerebral con software estándar. Para inducir actividades electrográficas similares a convulsiones, profusa la rebanada cerebral con ACSF que contiene 4-AP a 100 micromolares.
Vea la actividad eléctrica de la rebanada cerebral con software estándar. Para generar eventos electrográficos similares a convulsiones, utilizando la estrategia optogenética en las rebanadas cerebrales de ratones optogenéticos, utilice un manipulador manual para colocar una fibra óptica de 1.000 micras de diámetro del cordón directamente sobre la región de grabación. Aplique un breve pulso de luz azul para iniciar un evento ictal.
Un programa basado en MATLAB fácil de usar fue desarrollado específicamente para detectar y clasificar los diversos tipos de eventos epileptiformes que ocurren en los modelos de convulsiones in vitro e in vivo 4-AP. Este programa de detección está disponible en el repositorio GitHub de Valiante Labs. La aplicación de 100 micromolar 4-AP a buena calidad 450 micrones cerebrales corticales del tamaño de 450 micras de un ratón de canalrhodopsin VGAT juvenil, indujo de forma fiable eventos de ictal recurrentes en 15 minutos.
La aplicación de 100 micromolares 4-AP a rebanadas de mala calidad, resultó en eventos de ráfaga o actividad de pico. En promedio, el 40% de las rebanadas de cada cerebro preclínico diseccionado, generaron con éxito eventos similares a los ictal. Además, el 83% de los ratones diseccionados dieron como resultado al menos una rebanada cerebral que generó con éxito eventos similares a los ictal.
En las rebanadas cerebrales con eventos similares a los ictales, la aplicación de un breve pulso de luz de 30 milisegundos en la rebanada cerebral, desencadenó de forma fiable un evento similar al ictal que era idéntico en morfología. Los mismos hallazgos se hicieron en rodajas cerebrales de tu Channelrhodopsin dos ratones. Por lo tanto, independientemente de qué subpoblación neuronal se activó, cualquier breve evento de sincronización en la red neuronal cortical aislada, condujo a la aparición de un evento similar al ictal.
Estos eventos de forma ictal estaban compuestos por un pico centinela, disparos tónicos, disparos clonales y una actividad similar a una ráfaga hacia el final. Eran de naturaleza similar a las firmas electrográficas asociadas con las convulsiones clínicas. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros tipos de transiciones de estado cerebral para abordar preguntas como, ¿cuáles son los mecanismos neurobi biológicos subyacentes a las transiciones de estado cerebral?
¿Y cómo podemos regular estas transiciones para evitar la entrada en varios estados cerebrales patológicos?
