El objetivo general de este procedimiento es apuntar selectivamente a los teratomas derivados de células madre en ratones para evaluar la eficacia in vivo de la radioterapia de haz externo de animales pequeños. La principal ventaja de la radioterapia externa es que es una terapia dirigida para teramtomas asociados a células madre que evita los efectos adversos fuera de las dianas de las terapias administradas sistémicamente. Los avances en la radioterapia de haz externo han permitido la focalización específica de pequeños teratomas evitando el daño a los tejidos normales, por lo que esta terapia es ideal para el tratamiento de teratomas sensibles a la radiación.
Este método no sólo puede proporcionar información sobre la optimización de estrategias para terapias celulares, sino que también tiene el potencial de llegar a ser clínicamente aplicable en terapias humanas. Comience por tomar una placa de seis pocillos que contenga iPSC. Para inducir la formación de tetratoma en animales inmunodeficientes añadir un mililitro de mezcla de enzimas de disociación de células recombinantes por pozo de la placa de 6 pocillos que contiene células madre pluripotentes inducidas por humanos transducidas con un gen reportero de doble fusión para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación dispersar las células por pipeteo y detener la reacción enzimática mediante la adición de un volumen igual de medio de cultivo celular a cada pocóltico. Tire de las suspensiones de una sola célula en un tubo cónico de 15 mililitros para el recuento. Una vez completada la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 30 microlitros de la solución de matriz Matrigel y colocar el tubo sobre hielo.
Si se utilizan células trans infectadas reporte de doble fusión, estas células de doble efecto positivo también deben suspenderse en 30 microlitros de matriz. A continuación, cargue cada población celular en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 28,5 y confirme una falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo en cada ratón atyémico athímico anestesado de ocho a 10 semanas. Luego, inyectar por vía subcutánea una mezcla de matriz celular en el flanco dorsal de cada animal receptor.
En el momento experimental apropiado después de la inoculación inyectar 375 miligramos por kilogramo de deluciferón intraperitonealmente en cada receptor. Después de 10 minutos de imagen de la señal de bioluminiscencia en cada sonda de reportero anestesiada inyectado animal durante 30 minutos utilizando ventanas de adquisición de un minuto a intervalos de cinco minutos, de acuerdo con los protocolos de imágenes de bioluminiscencia estándar. Para la irradiación de teratoma, en el punto de tiempo experimental apropiado, coloque primero un animal receptor anestesiado en el lecho de un irradiador preclínico guiado por imágenes y adquiera un conjunto de 400 imágenes de tomografía microcalculada de proyección de más de 360 grados utilizando una kilotensión de 40 picos, un haz de rayos X de 2 miliamperios, y reconstruya la imagen en imágenes volumétricas con un tamaño de píxel isotrópico de 0,2 milímetros.
Es fundamental reconstruir imágenes volumétricas de los teratomas. Estas imágenes ayudarán a planificar los tratamientos de radiación para la administración específica de la terapia a los teratomas solamente, al tiempo que minimizan cualquier radiación fuera del objetivo de los tejidos circundantes. A continuación, utilice las imágenes de micro-CT y el paquete de software de imagen RT para planificar un protocolo de radioterapia.
Administrar el tratamiento durante tres días consecutivos para administrar un total de 18 grises al tumor objetivo. Los ratones inyectados suelen demostrar la formación de crecimiento del teratoma de cuatro a diez semanas después de la inyección de células tumorales, según lo confirmado por imágenes de bioluminiscencia. Cuando se irradia con un acumulativo hace de 18 grises un mes después del parto celular, los tumores se reducirán drásticamente, lo que resulta en una disminución significativa de la coincidencia en la señal luciferasa.
Es importante destacar que, como ilustran estas imágenes, las biopsias de tejido normales cosechadas de cinco mililitros del sitio irradiado no parecen sufrir ningún daño significativo. Después de ver este video, usted debe tener una comprensión clara de cómo crear teratomas derivados de células madre in vivo y para tratarlos de manera efectiva y segura con radiación de haz externo. Este enfoque simple requiere la adquisición de imágenes por TC de alta resolución de un sujeto después de lo cual se podrían prescribir una serie de terapias de haz de radiación para irradiar los tumores diana, evitando al mismo tiempo el tejido adyacente.
No olvide que trabajar con radiación puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones, como el uso de los escudos adecuados, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
