L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare selettivamente i teratomi derivati dalle cellule staminali nei topi per la valutazione dell'efficacia in vivo della radioterapia con fascio esterno di piccole dimensioni. Il principale vantaggio della radioterapia esterna con fascio di radiazioni è che è una terapia mirata per i teramtomi associati alle cellule staminali che evita gli effetti avversi off-targets delle terapie fornite sistemicamente. I progressi nella radioterapia con fascio esterno hanno permesso il targeting specifico di piccoli teratomi evitando danni ai tessuti normali, rendendo questa terapia ideale per il trattamento di teratomi sensibili alle radiazioni.
Questo metodo non solo può fornire informazioni sull'ottimizzazione delle strategie per le terapie cellulari, ma ha anche il potenziale per diventare clinicamente applicabile nelle terapie umane. Inizia prendendo una piastra da sei pomp po' contenente iPSC. Per indurre la formazione di tetratoma negli animali immunodifesa aggiungere un millilitro di miscela enzimatica di dissociazione cellulare ricombinante per pozzo della piastra a 6 pozzetti contenente cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo trasdotto con un gene reporter a doppia fusione per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione disperdere le cellule pipettando e fermare la reazione enzimatica aggiungendo un volume uguale di mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzo. Tirare le sospensioni a cella singola in un tubo conico da 15 millilitri per il conteggio. Al termine della centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 30 microlitri della soluzione a matrice Matrigel e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Se si utilizzano cellule trasfette da reportage a doppia fusione, queste cellule a doppio effetto positivo dovrebbero essere sospese anche in 30 microlitri di matrice. Successivamente, caricare ogni popolazione cellulare in una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 28,5 e confermare la mancanza di risposta al dito del piedino in ogni topo ricevente nudo atimico di otto-10 settimane anestetizzato. Quindi, iniettare per via sottocutanea una miscela di matrice cellulare nel fianco dorsale di ogni animale ricevente.
Nel momento sperimentale appropriato dopo l'inoculazione iniettare 375 milligrammi per chilogrammo di deluciferon intraperitonealmente in ciascun ricevente. Dopo 10 minuti immagine il segnale di bioluminescenza in ogni sonda reporter anestetizzata iniettato animale per 30 minuti utilizzando finestre di acquisizione di un minuto a intervalli di cinque minuti, secondo i protocolli standard di imaging a bioluminescenza. Per l'irradiazione del teratoma, nel momento sperimentale appropriato, posizionare innanzitutto un animale ricevente anestetizzato sul letto di un irradiatore preclinico guidato dall'immagine e acquisire una serie di 400 immagini di tomografia micro-calcolata di proiezione di oltre 360 gradi utilizzando un kilovoltage di picco di 40 picchi, un fascio di raggi X da 2 milliamp e ricostruire l'immagine in immagini volumetriche con una dimensione pixel isotropica di 0,2 millimetri.
È fondamentale ricostruire le immagini volumetriche dei teratomi. Queste immagini aiuteranno a pianificare i trattamenti radioterapici solo per la consegna specifica della terapia ai teratomi, riducendo al minimo qualsiasi radiazione off-target dei tessuti circostanti. Quindi utilizzare le immagini micro-CT e il pacchetto software di immagine RT per pianificare un protocollo di trattamento delle radiazioni.
Somministrare il trattamento per tre giorni consecutivi per fornire un totale di 18 grigi al tumore bersaglio. I topi iniettati in genere dimostrano la formazione di crescita del teratoma da quattro a cinque settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali come confermato dall'imaging della bioluminescenza. Quando irradiati con una fa cumulativa di 18 grigi un mese dopo il parto cellulare, i tumori si ridurranno drasticamente con conseguente significativa diminuzione coincidente del segnale luciferasi.
È importante sottolineare che, come dimostrano queste immagini, le normali biopsie tissutali raccolte da cinque millilitri dal sito irradiato non sembrano subire danni significativi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come creare teratomi derivati dalle cellule staminali in vivo e trattarli in modo efficace e sicuro con radiazioni del fascio esterno. Questo semplice approccio richiede l'acquisizione di immagini CT ad alta risoluzione di un soggetto dopo di che potrebbe essere prescritta una serie di terapie con fascio di radiazioni per irradiare i tumori bersaglio, evitando al contempo il tessuto adiacente.
Non dimenticare che lavorare con le radiazioni può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come l'uso degli scudi appropriati, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
