Los cardiomiocitos generados a partir de células de retorno pluripotente inducidas o ipS se utilizan cada vez más para responder a una variedad de preguntas biológicas en el campo de la electrofisiología cardíaca. Las principales ventajas de esta tecnología son que permite un aumento espectacular en el rendimiento, así como grabaciones potenciales de acción específica de subtipos en ventriculares como miocitos, utilizando un elemento promotor específico ventricular. La introducción de sensores de voltaje genéticamente codificados a través de la transducción lentiviral permite la imagen óptica de los potenciales de acción de células madre pluripotentes inducidas por el hombre.
Comience mezclando el sobrenadante de cultivo celular que contiene lentivirus con medio de mantenimiento de cardiomiocitos, en una proporción de uno a uno. Añadir bromuro de hexadimeterina a una concentración final de 8 microgramos por mililitro, para mejorar la eficiencia de la infección. Y reemplace el medio de mantenimiento de cardiomiocitos en el plato de cultivo de cardiomiocitos derivados de células IPS, con el medio de infección.
Cultivar los cardiomiocitos infectados durante 12 horas a 37 grados Celsius, y reemplazar el medio de infección con medio de mantenimiento de cardiomiocitos fresco. Antes de la toma de imágenes, cambie el medio de cultivo celular con la solución de Tyrode, complementada con calcio. A continuación, coloque los cardiomiocitos en una cámara de imágenes en el escenario de un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con un divisor de imagen.
Si se requiere un ritmo eléctrico, instale electrodos de ritmo en la cámara de imágenes y conecte los electrodos a un generador de estímulo. Ponga las células en el foco, y localice una célula que exprese el indicador de voltaje genéticamente codificado en el centro del campo de visualización. Establezca la ruta óptica para que la luz emitida se enrute al divisor de imagen y cambie el cubo de filtro en el microscopio al que se combina con los filtros del divisor de imagen.
En el software que controla la cámara, establezca la configuración de adquisición para que sea posible obtener imágenes de alta velocidad y configure el divisor de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las dos imágenes que representan las dos bandas de longitud de onda de emisión diferentes deben estar adyacentes entre sí, cada una ocupando la mitad de la imagen. Compruebe y ajuste el enfoque de la imagen producida por la cámara según sea necesario.
Y ajusta el brillo de la luz de iluminación para evitar la saturación de píxeles. Establezca la adquisición de la serie temporal y atenúe la luz en la habitación para evitar que la luz perdida influya en la medición. A continuación, abra el obturador de luz de excitación y comience la adquisición de la serie de imágenes, iniciando el ritmo eléctrico en el punto de tiempo adecuado, según sea experimentalmente apropiado.
Cuando finalice la adquisición, cierre el obturador de luz de excitación según sea necesario y guarde la grabación en el disco duro. A continuación, dejando el ajuste de grabación sin cambios, registre el fondo sobre una región del cubreobjetos sin celdas. Para el análisis de las grabaciones potenciales de membrana óptica, abra la pila tiff que contiene las células en ImageJ, y utilice la herramienta de selección a mano alzada para dibujar una región de interés sobre un cardiomiocito fluorescente, en el canal rojo, teniendo cuidado de que el área sea lo suficientemente grande como para que la célula no se mueva fuera de la región mientras se contrae.
A continuación, seleccione Analizar, Herramientas, Region Of Interest Manager y seleccione Agregar T para agregar la región como Región de interés 1. Arrastre la región de interés sobre la misma celda en el canal verde y agregue esta región como Región de interés 2. En los menús Analizar y Establecer medidas, anule la selección de todas las opciones excepto el valor Gris medio.
En el Administrador de regiones de interés, haga clic en Más y Multi medida para seleccionar las opciones Medir todos los sectores y Una fila por sector y haga clic en Aceptar. Se abrirá una ventana que contiene una hoja de cálculo con las tres filas. Utilice Archivo y Guardar como para guardar la hoja de cálculo en un archivo de valores separados por comas. Cierre la ventana con la pila de imágenes y la ventana de hoja de cálculo sin cerrar la ventana Región del Administrador de intereses y abra la pila tiff que contiene la medición de fondo.
En el Administrador de regiones de interés, haga clic en Más y Multi medida para seleccionar las opciones Medir todos los sectores y Una fila por sector y haga clic en Aceptar. A continuación, guarde los datos en segundo plano en un archivo csv independiente. Aquí, se representa un cardiomiocitos derivado de células IPS único representativo con las líneas de puntos blancas que marcan las regiones de interés, dibujadas durante el análisis de imágenes en los canales RFP y GFP. La señal del canal RFP demuestra un aumento periódico de la intensidad fluorescente durante cada potencial de acción debido a una transferencia de energía forzada o de resonancia creciente causada por cambios en el potencial de la membrana.
Concordantemente, la señal GFP exhibe una disminución periódica en la intensidad fluorescente. La relación RFP/GFP es la señal biológica utilizada en los análisis posteriores, como las mediciones de duración potencial de acción 50 y 90. Por ejemplo, utilizando este método, ventricular de 30 días de edad como cardiomiocitos derivados de células IPS colocados en 0,5 Hercios, mostraron una duración potencial de acción media 50 de 439 milisegundos, y una duración potencial de acción media 90 de 520 milisegundos.
La estimulación eléctrica de los cardiomiocitos derivados de células IPS a tasas de estimulación crecientes cada cinco latidos, demostró un acortamiento progresivo de los potenciales de acción a medida que aumentaba la tasa de superación. Por otra parte, el tratamiento de los cardiomiocitos derivados de células IPS que golpean espontáneamente con isoproternol, un agonista del receptor beta adreno no selectivo, condujo a un rápido aumento de la tasa de golpes, que podría aumentarse aún más con el aumento de las dosis del agonista. Si bien este método proporciona un rendimiento superior en comparación con las mediciones electrofisiológicas clásicas, uno debe ser consciente de sus limitaciones, incluyendo una resolución temporal que está limitada por las propiedades cinéticas intrínsecas del sensor de voltaje fluorescente.
