La evaluación de la seguridad cardíaca es un componente crucial durante el proceso de desarrollo del fármaco. Los cardiomiocitos derivados de iPSC humanos han demostrado ser un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Hemos establecido metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, que son de modelado de enfermedades realmente importantes, detección de toxicidad cardiovascular inducida por fármacos y medicina de precisión.
La creciente incorporación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC en el proceso estándar de evaluaciones de seguridad preclínicas tiene el potencial de mejorar la precisión de la predicción de toxicidad de los compuestos de un candidato. Comience cultivando los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC durante al menos 10 días antes de tomar la medición. Encienda el controlador de temperatura y configúrelo a 37 grados centígrados.
Encienda el microscopio, la cámara y el suministro de dióxido de carbono. Llene la camisa de agua del soporte de la placa con una cantidad adecuada de agua desionizada estéril. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa e incube las células durante al menos cinco minutos.
Abra el software de visualización y, a continuación, ajuste la velocidad de fotogramas de la cámara a 75 fotogramas por segundo y la resolución de vídeo o imagen a 1024 x 1024 píxeles. Aplique las funciones de enfoque automático y brillo automático, grabe videos e imágenes de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. Coloque cuidadosamente una gota de ocho microlitros de solución de recubrimiento de matriz extracelular sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos de 48 pocillos.
Luego agregue tres mililitros de agua desionizada estéril al área que rodea los pozos para evitar la evaporación de la solución de recubrimiento. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, retire la mayor parte del medio de matriz extracelular de la superficie del pozo dentro de la misma fila o columna sin tocar los electrodos. Semilla 50, 000 células por pocillo en una gota de ocho microlitros de medio de siembra sobre el área del electrodo de registro.
Repita hasta que todos los pocillos hayan sido chapados con células. Luego incube las placas de matriz de microelectrodos en una incubadora de cultivo celular humidificada. Agregue lentamente 150 microlitros de medio de siembra a cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos.
En el día 10 después del recubrimiento, verifique la densidad de la monocapa humana iPSC CM de batido espontáneo bajo un microscopio. Coloque la placa de matriz de microelectrodos de 48 pocillos en el instrumento de grabación. Asegúrese de que la temperatura sea de 37 grados centígrados y que el dióxido de carbono sea del 5%Abra el software del navegador.
En la ventana de configuración experimental, seleccione la configuración cardíaca en tiempo real y los registros de potencial de campo. Aplicar configuraciones de batido espontáneas o pegadas. En los parámetros de detección de latidos, establezca el umbral de detección en 300 microvoltios, el período de batido mínimo en 250 milisegundos y el período máximo de latido en cinco segundos.
Seleccione la regresión polinómica para el cálculo de la duración del potencial de campo. Compruebe si la señal de actividad eléctrica basal está madura y estable, y adquiera las actividades cardíacas basales durante uno a tres minutos. Realizar la grabación 10 días después del chapado.
Reemplace el medio de mantenimiento iPSC CM humano con la solución de tyrode y permita que las células se aclimaten durante 15 minutos. Inserte los sensores de temperatura en la cámara y coloque el plato de 35 milímetros dentro. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.
Extraiga las micropipetas de los capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de micropipetas. Llene las micropipetas con la solución intracelular e insértelas en el soporte conectado a la etapa de cabeza del amplificador de abrazadera de parche. Abra el software de adquisición, cargue el protocolo de grabación de potencial de acción y seleccione la configuración de abrazadera de voltaje.
Inserte la micropipeta en la solución de baño y seleccione los CM iPSC humanos individuales apropiados. Ajuste y baje la posición de la micropipeta junto a la celda seleccionada utilizando un micromanipulador. Cuando se inserte la punta de la pipeta en la solución de baño, compruebe la resistencia de la pipeta en el monitor del osciloscopio.
Coloque la pipeta cerca de la celda y los pulsos de corriente disminuirán ligeramente para reflejar la creciente resistencia del sellado. Aplique una succión suave con presión negativa para aumentar la resistencia. Esto formará un gigaseal.
A continuación, aplique la función de sello. Aplique succión adicional para romper la membrana para obtener una configuración de registro de células completas. En este punto, cambie del modo de abrazadera de voltaje al modo de abrazadera de corriente, o sin inyección de corriente usando el diálogo del amplificador.
Presione el botón de grabación para generar y guardar los archivos de grabación potenciales de acción. Realice la medición transitoria de calcio al menos 10 días después del recubrimiento. Prepare la solución fresca de Tyrode y la solución de carga Fura-2 AM.
Aspirar el medio de mantenimiento iPSC CM humano y lavar las cámaras con la solución de Tyrode dos veces. Aplique 100 microlitros de solución de carga Fura-2 AM e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Reemplace la solución de carga Fura-2 AM con la solución de Tyrode e incube durante al menos cinco minutos para la desesterificación completa de Fura-2 AM. Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo de inmersión en aceite 40x de un microscopio de epifluorescencia invertida.
Coloque la cámara celular en el adaptador de etapa del microscopio. Instale los cables del controlador de temperatura en la cámara de baño y configúrela a 37 grados centígrados. Instale los electrodos de estimulación del campo eléctrico y ajuste los pulsos a 0,5 hercios con una duración de 20 milisegundos.
Encienda la fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad y configúrela en modo de conmutación rápida de 340 nanómetros y 380 nanómetros. Aplique un tiempo de exposición de 20 milisegundos para ambas longitudes de onda y un tiempo de grabación de 20 segundos. Grabe el video que refleja los cambios en tiempo real del calcio transitorio, exporte los datos a una hoja de cálculo para su análisis.
Se utilizaron cardiomiocitos monocapa derivados de iPSC humana para la medición del movimiento de contracción. El análisis de un rastro del movimiento de relajación de la contracción utilizando el software analizador detectó el inicio de las contracciones, el pico de contracción, el final de la contracción, el pico de relajación y el final de la relajación. Se observó una cobertura completa de la monocapa de cardiomiocitos derivados de iPSC humana en todos los electrodos dentro de las placas de matriz de microelectrodos.
Las formas de onda maduras registradas por cada electrodo reflejaban el potencial del campo cardíaco con características identificables. Después del análisis, se obtuvieron el período de latido, la duración del potencial de campo y la amplitud del pico. Los registros de pinza de parche de células enteras en el modo de pinzamiento actual registraron los potenciales de acción espontánea de cardiomiocitos individuales.
Después del análisis, se obtuvieron varios parámetros, incluyendo la amplitud, el potencial diastólico máximo y la duración del potencial de acción. Después del análisis de las imágenes de calcio, se obtuvo la relación F340 por F380 a lo largo del tiempo, y se trazaron trazas crudas de transitorios de calcio estimulados. Además, se obtuvieron parámetros como amplitud, calcio diastólico y desintegración cálcica tau.
Es importante utilizar los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC que se encuentran en buenas condiciones de latido, así como para garantizar la alta pureza de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. Este protocolo incluye cuatro técnicas específicas para estudiar la funcionalidad de los cardiomiocitos derivados de iPSC humanas, otra configuración o automática, si se deben estudiar las corrientes iónicas cardíacas que desempeñan un papel crucial en el
