Este método pode ajudar a responder algumas perguntas no método de campo da malignidade sobre a caracterização de uma célula que inicia uma malignidade. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma base para a análise funcional dessas células-tronco cancerígenas. As implicações dessa técnica se estendem até onde a terapia de síndromes mielodsplásicas ou MDS, pois pode auxiliar na identificação da doença que inicia as células.
Para preparar os receptores para transferência adotiva, uma semana antes do transplante fornecem água estéril suplementada com 100 miligramas por litro de ciprofloxacina para con receptor gênico ANIMAIS por sete dias em uma instalação animal específica e livre de patógenos. No sétimo dia, tenha um operador de césio 17 treinado e certificado que estabeleceu o instrumento de origem do césio para entregar 70 centigrayS de irradiação gama corporal total por minuto. Coloque 10 ratos em um suporte personalizado.
Insira o suporte na câmara irradiadora, entregue 9 cinzas de irradiação total do corpo em 13 minutos. Então devolva os animais para suas gaiolas. Na manhã seguinte, pulverize 70% de etanol sobre um rato preto C57 preto c57 inteiro e use uma tesoura para remover a pele da pélvis até os tornozelos.
Use fórceps com a tesoura para remover a femora e a tíbia. Aparar os músculos dos ossos. Corte as extremidades proximal e distal para a tíbia e pegue uma tíbia com fórceps.
Insira uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 27 gage na cavidade da medula óssea e coloque a medula óssea em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros contendo 2,5 mililitros de solução salina tamponada hanks complementada com soro bovino fetal de 2% ou HF2. Quando toda a medula tiver sido coletada, aspire o tecido várias vezes através da ponta da agulha de 20 gage para dispersar a massa da medula em uma única suspensão para contar. Para rotular as células nucleadas da medula óssea, ou BMNC, para classificação de fluxo, coletar as células por centrifugação e suspender novamente a pelota em uma vez dez a dez para o sétimo BMNC por 90 microliters de concentração de HF2.
Em seguida, adicione dez microliters de um coquetel de anticorpos anti-linhagem biotinilado à suspensão celular para incubação de 20 minutos a 4 graus Celsius. Seguido por uma lavagem centrífuga em três mililitros de PBS. Suspenda a pelota em 100 microliters de HF2 por uma vez dez a sete células.
Em segundo lugar, rotule as células com dois microliters de anticorpo anti-biotina conjugado APC. Depois de 20 minuetos a quatro graus Celsius, protegidos da luz, lave as células em três mililitros de PBS fresco. Suspender a pelota em HF2 suplementada com 0,2 microgramas por mililitro de iodeto de propídio no gelo.
Agora, calibrar o classificador de células de citometria de fluxo usando células não manchadas para otimizar todos os tubos fotomultiplier, dispersão e parâmetros de fluorescência dentro da faixa linear de cada detector. Adquira três amostras de 10.000 células para as células rotuladas APC não rotuladas, pi rotuladas e anti-linhagem. Ao final do tipo, analise 1.000 células de cada amostra para confirmar a pureza e viabilidade das células classificadas.
Gire as amostras na centrífuga. Em seguida, suspenda novamente as pelotas em 0,5 mililitros de HF2 para contagem. Para transferência adotiva das células classificadas, misture 100 microlitadores de duas vezes o quinto BMNC do tipo selvagem de um animal receptor con gênico em HF2 estéril.
Com 100 microlitadores de duas a cinco vezes dez para o quarto o doador classificado BMNC de interesse em HF2 estéril em um tubo de micro centrífugas por animal receptor. Carregue uma seringa mililitro, equipada com 28 gage por receptor com 200 microliters de células. Em seguida, coloque os camundongos receptores sob uma lâmpada de calor para induzir a dilatação da veia da cauda.
Entregue as misturas celulares a cada animal receptor letalmente irradiado através da veia da cauda. Como a auto-renovação das células-tronco se limita à linhagem negativa do tipo selvagem BMNC, as células negativas de linhagem negativa, positivas de linhagem baixa e alta linhagem são classificadas e transplantadas em receptores do tipo selvagem para determinar a capacidade de autoconexão de cada população celular. Adotivamente transplantado doador trans genético BMNC de animais modelo MDS pode ser distinguido ex vivo por sua expressão de marcador de superfície celular CD45.2.
Por 16 semanas após o transplante de linhagem negativa BNMC, ou BMNC não consorciado de animais doadores transgênicos de MDS, as células transgênicas competem com as células do tipo selvagem, como evidenciado por uma porcentagem crescente de células doadoras positivas de CD45,2, observadas no sangue periférico dos animais receptores letalmente irradiados. Aqui são mostradas células de uma transformação leucêmica de um rato transplantado com células transgênicas de MDS. Note a presença de numerosas explosões e formas imaturas.
Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de limitar o tempo de manipulação ex vivo, pois pode colocar estresse indevido nas células, resultando em morte celular ou perda funcional. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para os pesquisadores do programa de campo, para colocar em malignidade explorar a origem da doença em camundongos geneticamente modificados.
