Bu yöntem, malignite başlatan bir hücrenin karakterizasyonu hakkında malignite alanı yönteminde birkaç soruya cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu kanser kök hücrelerinin fonksiyonel analizi için bir temel sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri nerede miyelodisplastik sendromlar veya MDS tedavisi uzanır, bu hastalığın başlatıcı hücrelerin belirlenmesinde yardımcı olabilir gibi.
Alıcıları evlat edinme transferine hazırlamak için, nakilden bir hafta önce, belirli bir patojensiz hayvan tesisinde yedi gün boyunca alıcı ANIMALS'ı con genic alıcısına litre başına 100 miligram siprofloksasin ile takviye steril su sağlar. Yedinci gün, eğitimli, sertifikalı sezyum 17 operatör dakikada toplam vücut gama ışınlama 70 centigrayS sunmak için sezyum kaynak aleti ayarlayın. 10 fareyi özel olarak tasarlanmış bir tutucuya yerleştirin.
Tutucuyu ışınlama odasına takın, 13 dakikada 9 gri toplam vücut ışınlaması gerçekleştirin. Sonra hayvanları kafeslerine geri getirin. Ertesi sabah, sprey yüzde 70 etanol bütün bir iki ila altı güve eski C57 siyah altı fare ve ayak bileklerine leğen kemiği deri kaldırmak için makas kullanın.
Femora ve tibiae kaldırmak için makas ile forceps kullanın. Kemiklerdeki kasları temiz bir şekilde kırpın. Tibiae için proksimal ve distal uçları kesin ve forseps ile bir tibia almak.
Kemik iliği boşluğuna 27 gage iğneile donatılmış üç mililitrelik şırınga yerleştirin ve kemik iliğini 2.5 mililitrelik Hanks tamponlu serum veya HF2 ile takviye edilmiş 2.5 mililitrelik bir tüp içeren 14 mililitrelik yuvarlak alt tüpe boşaltın. Tüm ilik toplandığında, 20 gage iğne ucu ile doku birkaç kez aspire sayma için tek bir süspansiyon içine ilik kütlesi dağıtmak için. Akış ayıklama için kemik iliği çekirdekli hücreleri etiketlemek için, santrifüj asyon hücreleri toplamak ve hf2 konsantrasyonu 90 mikrolitre başına yedinci BMNC bir kez on pelet askıya.
Daha sonra, 4 santigrat derece 20 dakikalık kuluçka için hücre süspansiyon için bir biyotinylated, anti-soy antikor kokteyl on mikrolitre ekleyin. Ardından üç mililitre PBS'de santrifüj yıkama. Tekrar yedinci hücrelere on kez on başına HF2 100 mikrolitre pelet askıya.
İkinci olarak apc konjuge anti biotin antikor iki mikrolitre ile hücreleri etiket. Dört derece santigrat 20 minuets sonra, ışıktan korunan, taze PBS üç mililitre hücreleri yıkayın. HF2'deki peleti tekrar askıya alın ve buz üzerinde propidium iyodürünün mililitresine 0.2 mikrogram verin.
Şimdi her dedektörün doğrusal aralığındaki tüm fotoçarpan tüpleri, dağılım ve floresan parametrelerini optimize etmek için lekesiz hücreleri kullanarak akış sitometri hücre ayırıcısını kalibre edin. Etiketlenmemiş, PI etiketli ve anti soy APC etiketli hücreler için 10.000 hücreden oluşan üç örnek edinin. Sıralamanın sonunda, sıralanmış hücrelerin saflığını ve canlılığını doğrulamak için her örnekten 1.000 hücreanaliz edin.
Santrifüjdeki örnekleri aşağı çevirin. Daha sonra sayma için HF2 0,5 mililitre pelet askıya. Sıralanmış hücrelerin benimseyen transferi için, steril HF2'deki bir alıcı hayvandan beşinci vahşi tip BMNC'nin iki katı kadar 100 mikrolitre karıştırın.
Alıcı hayvan başına bir mikro santrifüj tüp steril HF2 ilgi sıralanmış donör BMNC dördüncü 2-5 kat 100 mikrolitre ile. 200 mikrolitre hücre ile alıcı başına 28 gage ile donatılmış bir mililitreşşük şırınga yükleyin. Daha sonra, kuyruk damar genişlemesi neden bir ısı lambası altında alıcı fareler yerleştirin.
Kuyruk damarı ile her öldürücü ışınlanmış alıcı hayvana hücre karışımları teslim. Kök hücre kendini yenileme soyu negatif yabani tip BMNC ile sınırlı olduğundan, soy negatif, düşük soy pozitif ve yüksek soy pozitif hücreler sıralanır ve her hücre popülasyonunun kendini yenileme kapasitesini belirlemek için yabani tip alıcılara nakledilir. MDS model hayvanlardan adoptively nakledilen donör trans genetik BMNC onların CD45.2 hücre yüzey marker ekspresyonu ile ex vivo ayırt edilebilir.
Transgenik MDS donör hayvanlardan soy negatif BNMC veya sıralanmamış BMNC naklinden 16 hafta sonra, transgenik hücreler, öldürücü ışınlanmış alıcı hayvanların periferik kanda gözlenen CD45.2 pozitif donör hücrelerinin artan bir yüzdesi ile kanıtlanan vahşi tip hücrelerle rekabet eder. Burada transgenik MDS hücreleri ile nakledilen bir fareden lösemik dönüşüm hücreleri gösterilmiştir. Çok sayıda patlamalar ve olgunlaşmamış formları varlığı na dikkat edin.
Prosedürü denerken, hücre ölümü veya fonksiyonel kayıp ile sonuçlanan hücreler üzerinde aşırı stres yerleştirebilirsiniz gibi, ex vivo manipülasyon süresini sınırlamak için hatırlamak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, genetik olarak tasarlanmış farelerde hastalığın kaynağını araştırmak için maligniteyi ortaya koymak için, alan programındaki araştırmacıların önünü açıyor.
