이 방법은 악성 종양을 시작하는 세포의 특성화에 대한 악성 필드의 방법에있는 몇 가지 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 암 줄기 세포의 기능적 분석을 위한 기초를 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 밀로이드 플라스틱 증후군 또는 MDS의 치료가 세포를 시행성화하는 질병의 식별에 도움이 될 수 있기 때문에 확장됩니다.
입양 이송을 위해 수령인을 준비하기 위해 이식 1주일 전에 시프로플로사신 리터당 100밀리그램을 보충하여 특정 병원체 가없는 동물 시설에서 7일 동안 genic 받는 사람 동물을 속입니다. 일곱 째 날, 훈련된 공인 세슘 17 운영자가 분당 총 신체 감마 조사 70센티미터를 전달하기 위해 세슘 소스 장비를 설정했습니다. 사용자 정의 설계 홀더에 10 마우스를 배치합니다.
홀더를 조사실에 삽입하고 13분 만에 9개의 회색 총 신체 조사를 제공합니다. 그런 다음 동물을 새장에 반환합니다. 다음 아침, 전체 2 ~ 6 나방 오래된 C57 검은 여섯 마우스에 70 %의 에탄올을 스프레이하고 발목에 골반에서 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
가위와 함께 집게를 사용하여 페모라와 경골을 제거하십시오. 뼈에서 근육을 깨끗하게 다듬습니다. 경골에 대 한 근위 및 말단 끝을 잘라 하 고 집게와 하나의 경골을 선택.
골수 구멍에 27 게이지 바늘을 장착 한 3 밀리리터 주사기를 삽입하고 2 %의 태아 소 혈청 또는 HF2로 보충 된 행크스의 2.5 밀리리터S를 포함하는 14 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 골수를 플러시하십시오. 모든 골수가 수집되면, 20 게이지 바늘 끝을 통해 조직을 여러 번 흡인하여 골수 질량을 하나의 현탁액으로 분산시다. 골수 핵세포 또는 BMNC를 유량 선별에 라벨을 부착하기 위해, 심방화에 의해 세포를 수집하고 HF2 농도의 90 마이크로리터 당 10~7번째 BMNC로 10회에서 펠릿을 다시 중단한다.
다음으로, 생체 화, 안티 리니지 항체 칵테일의 10 마이크로 리터를 세포 현탁액에 섭씨 4도에서 20 분 동안 배양하십시오. 그 다음에 는 PBS의 3 밀리리터에서 원심분리기 세척이 진행됩니다. 7세포에 1회 1회 당 HF2의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다.
이체는 APC의 2개의 마이크로리터로 세포를 라벨로 분류하여 항비오틴 항체를 공주한다. 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 20개의 미네에트 후, 신선한 PBS의 3밀리리터로 세포를 씻으십시오. 다시 HF2에서 펠릿을 일시 중단 하여 0.2 얼음에 프로피듐 요오드의 밀리 리터 당 마이크로 그램보충.
이제 스테인드 된 세포를 사용하여 유동 세포 분석 셀 선별기를 보정하여 각 검출기의 선형 범위 내에서 모든 광증 증식 관, 산란 및 형광 파라미터를 모두 최적화합니다. 표지되지 않은 PI 표지및 안티 리니지 APC 표지셀에 대해 10, 000 셀의 3개의 샘플을 획득한다. 정렬의 끝에서, 정렬 된 세포의 순도 및 생존가능성을 확인하기 위해 각 샘플에서 1, 000 세포를 분석한다.
원심분리기의 샘플을 회전시. 그런 다음 계산을 위해 HF2의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 선별된 세포의 양용 전달을 위해, 멸균 HF2에서 원조양동물로부터 제5 야생형 BMNC에 2배의 마이크로리터 100개를 혼합한다.
100 마이크로리터를 10~5회 10회 10회 10회 까지, 수령인 동물당 마이크로 원심분리기 튜브에서 멸균 HF2에 대한 관심있는 선별된 기증자 BMNC. 200 마이크로리터의 셀을 받는 사람당 28개의 게이지를 장착한 밀리리터 주사기 1개를 적재합니다. 이어서, 수신자 마우스를 열램프 아래에 놓으면 꼬리 정맥 팽창을 유도한다.
꼬리 정맥을 통해 각 치명적으로 조사 받는 사람 동물에 세포 혼합물을 전달합니다. 줄기세포자가재생은 계보 음성야생형 BMNC에 국한됨에 따라, 리니지 네거티브, 낮은 계보 양성, 및 고계 양성 세포는 각 세포 집단의 자기 재생 능력을 결정하기 위해 야생형 수령인으로 분류및 이식된다. MDS 모델 동물로부터 의학적으로 이식된 기증자 트랜스 유전 BMNC는 CD45.2 세포 표면 마커 발현에 의해 전 생체를 구별할 수 있다.
혈통 의 이식 후 16 주 부정적인 BNMC, 또는 형질형 MDS 기증자 동물에서 분류되지 않은 BMNC, 트랜스 제닉 세포 밖으로 CD45.2 양성 기증자 세포의 증가 비율에 의해 입증된 바와 같이 야생 형 세포경쟁, 치명적인 조사 받는 동물의 말초 혈액에서 관찰. 여기서 형질전환 MDS 세포로 이식된 마우스로부터의 백혈병 변환으로부터의 세포가 나타난다. 수많은 폭발과 미숙한 형태의 존재를 유의하십시오.
절차를 시도하는 동안, 세포에 과도한 스트레스를 배치 할 수 있기 때문에 전 생체 조작의 시간을 제한하는 것이 중요합니다, 세포 죽음 또는 기능적 손실의 결과로. 개발 후이 기술은 유전 으로 조작 된 마우스에서 질병의 근원을 탐구하기 위해 악성 종양에 넣어 현장 프로그램에 있는 연구원을 위한 길을 포장합니다.
