Diese Methode kann helfen, einige Fragen in der Methode der Bösartigkeit Feld über die Charakterisierung einer Zelle, die eine Malignität initiieren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine Grundlage für die funktionelle Analyse dieser Krebsstammzellen bietet. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf den Ort, an dem die Therapie von myelodysplastischen Syndromen oder MDS hilft, da sie bei der Identifizierung der Krankheit helfen kann, die Zellen ausihrittiert.
Um die Empfänger auf den Adoptivtransfer vorzubereiten, stellen Sie eine Woche vor der Transplantation steriles Wasser zur Verfügung, das mit 100 Milligramm pro Liter Ciprofloxacin ergänzt wird, um den Empfänger ANIMALS für sieben Tage in einer bestimmten, pathogenfreien Tieranlage zu erhalten. Am siebten Tag haben sie einen geschulten, zertifizierten Cäsium-17-Operator eingestellt, der das Cäsium-Quellinstrument so eingestellt hat, dass 70 CentigrayS der gesamten Körpergamma-Bestrahlung pro Minute bereitgestellt werden. Platz 10 Mäuse in einem maßgeschneiderten Halter.
Setzen Sie den Halter in die Bestrahlungskammer ein, liefern Sie 9 Graustufen gesamtkörperbestrahlung in 13 Minuten. Dann bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück. Am nächsten Morgen sprühen Sie 70 Prozent Ethanol über ganze zwei bis sechs Motten alte C57 schwarze Sechsmaus und verwenden Sie eine Schere, um die Haut aus dem Becken zu den Knöcheln zu entfernen.
Verwenden Sie Zangen mit der Schere, um die Femora und Tibiae zu entfernen. Schneiden Sie die Muskeln sauber von den Knochen. Schneiden Sie die proximalen und distalen Enden für die Tibiae und nehmen Sie eine Tibia mit Zange.
Legen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gage-Nadel in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark in ein 14 Milliliter rundes Unterrohr mit 2,5 Millilitern Hanks gepufferter Salinelösung, ergänzt mit 2%fetalem Rinderserum oder HF2. Wenn das gesamte Mark gesammelt wurde, saugen Sie das Gewebe mehrmals durch die 20-Gage-Nadelspitze, um die Markmasse in eine einzige Suspension zum Zählen zu zerstreuen. Um die Knochenmarkkernzellen (BMNC) für die Durchflusssortierung zu kennzeichnen, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugalisierung und setzen Sie das Pellet um ein mal zehn bis siebtes BMNC pro 90 Mikroliter HF2-Konzentration wieder auf.
Als nächstes fügen Sie zehn Mikroliter eines biotinylierten Anti-Lineage-Antikörpercocktails für eine 20-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius in die Zellsuspension. Gefolgt von einer Zentrifuge waschen in drei Milliliter PBS. Das Pellet in 100 Mikroliter HF2 pro zehn mal bis zur siebten Zelle aussetzen.
Etikettieren Sie die Zellen sekundär mit zwei Mikrolitern konjugierten Antibiotin-Antikörpers. Nach 20 Minuets bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt, waschen Sie die Zellen in drei Milliliter nfrischem PBS. Das Pellet in HF2, ergänzt um 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid auf Eis, wird wieder ausgesetzt.
Kalibrieren Sie nun den Flow-Zytometrie-Zellsortierer mit ungefärbten Zellen, um alle Photomultiplier-Röhren, Streu- und Fluoreszenzparameter innerhalb des linearen Bereichs jedes Detektors zu optimieren. Erwerben Sie drei Proben von 10.000 Zellen für die nicht beschrifteten, PI-beschrifteten und Anti-Lineage-APC-markierten Zellen. Analysieren Sie am Ende der Sortierung 1 000 Zellen aus jeder Probe, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der sortierten Zellen zu bestätigen.
Drehen Sie die Proben in der Zentrifuge nach unten. Dann die Pellets in 0,5 Milliliter HF2 zum Zählen wieder aussetzen. Für die Adoptivübertragung der sortierten Zellen 100 Mikroliter des zweifachen bis fünften Wildtyp-BMNC von einem kongenen Empfängertier in sterilem HF2 mischen.
Mit 100 Mikrolitern von zwei bis fünf Mal zehn bis vier interessierte sich der sortierte Spender BMNC für steriles HF2 in einem Mikrozentrifugenrohr pro Empfängertier. Laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, ausgestattet mit einem 28-gage pro Empfänger mit 200 Mikroliter Zellen. Legen Sie dann die Empfängermäuse unter eine Wärmelampe, um eine Schwanzvenendilatation zu induzieren.
Liefern Sie die Zellmischungen über die Schwanzvene an jedes tödlich bestrahlte Empfängertier. Da die Stammzell-Selbsterneuerung auf Linien negative Sendeart BMNC beschränkt ist, werden Liniennegativ, niedrige Abstammung positive und hohe Abstammung positive Zellen sortiert und in Wildtyp-Empfänger transplantiert, um die Selbsterneuerungskapazität jeder Zellpopulation zu bestimmen. Adoptiert transplantierte Spender transgenetische BMNC von MDS-Modelltieren kann ex vivo durch ihre CD45.2-Zell-Oberflächenmarker-Expression unterschieden werden.
16 Wochen nach der Transplantation von leinennegativem BNMC oder unsortiertem BMNC von transgenen MDS-Spendertieren konkurrieren die transgenen Zellen mit den Wildtypzellen, wie ein zunehmender Prozentsatz von CD45.2-positiven Spenderzellen zeigt, die im peripheren Blut der tödlich bestrahlten Empfängertiere beobachtet werden. Hier werden Zellen aus einer leukämischen Transformation einer Maus gezeigt, die mit transgenen MDS-Zellen transplantiert wurde. Beachten Sie das Vorhandensein zahlreicher Explosionen und unreifer Formen.
Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Zeit der Ex-vivo-Manipulation zu begrenzen, da es übermäßige Belastung der Zellen setzen kann, was zu Zelltod oder Funktionsverlust führt. Nach der Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für die Forscher im Feldprogramm, für die Anwendung von Malignität, um die Quelle der Krankheit bei gentechnisch veränderten Mäusen zu erforschen.
