Este método de detección basado en nanoporos ha demostrado el potencial de caracterizar e identificar físicamente moléculas individuales. Trabajar con metalo-nanopartículas, que es el propósito de este video, está desafiando nuestra comprensión de lo que limita la precisión y la precisión de la medición. La principal ventaja de esta técnica es que este aparato tiene mayor ancho de banda que la configuración tradicional de memoria bicapa lipídica, lo que nos permite ver resultados más rápidos y más reacciones en nanoporos.
Esta técnica fue posible porque a principios de la década de 1990 se demostró que la gating en nanoporos proteicos, es decir, el cambio entre diferentes estados, se puede controlar y las moléculas pueden unirse a la pared de los poros. Esta técnica se está desarrollando para aplicaciones comerciales de secuenciación de ADN porque utiliza muestras mínimas. No requiere etiquetas fluorescentes y utiliza longitudes de lectura mucho más largas que los métodos convencionales.
Esta técnica también ha sido desarrollada para discriminar entre polímeros en función de su tamaño con mayor precisión y velocidad que la electroforesis de gel y la cromatografía. En primer lugar, preparar 500 mililitros de una solución de cloruro sódico de un molar y fosfato monosódico de 10 mililitros en agua ultrapura como electrolito. Lo mejor es utilizar soluciones y muestras frescas con esta configuración en particular.
Además, encontramos que el agua desionizada de alta calidad es muy importante para formar con éxito las membranas. A continuación, combine un miligramo de polvo monomérico de tipo S.aureus alfa hemolysin liofilizado con un mililitro de agua ultrapura. No olvides que trabajar con la proteína toxina stafita aureus alfa hemolysin puede ser peligroso.
Siga las precauciones del MSDS al realizar este procedimiento. A continuación, preparar cuatro mililitros de cinco miligramos por mililitro DPhyPC en endecaine en un vial de centelleo de vidrio. Tapa el vial con una tapa forrada de politetrafluoroetileno y guárdalo a cuatro grados centígrados durante un mes.
Después de eso, disolver 57,6 miligramos de 12-fosfotúncístico ácido hidrato en 10 mililitros del electrolito para hacer una solución de polioxometalato de dos milímetros. Divida la solución POM en dos porciones de cinco mililitros. Utilice hidróxido de sodio de tres molares para ajustar el pH de una solución POM a 5.5.
Para comenzar a prepararse para la prueba, ensamble la célula de ensayo de un aparato de electrofisiología de la bicapa de lípidos planos. En primer lugar, abrasar un alambre de plata con papel de lija de 600 granos y remojarlo en lejía a base de hipoclorito de sodio disponible comercialmente durante 10 minutos para hacer el electrodo de alambre de cloruro de plata plateada. Enjuague y seque el electrodo de alambre antes de insertarlo en el capilar de cuarzo del aparato.
Mantenga el electrodo dentro de la membrana de cuarzo-nanoporo, o QNM, separando el capilar y el depósito. A continuación, coloque un electrodo de pellet de cloruro de plata y plata cilíndrico montado en un alambre de plata en el depósito. Conecte ambos electrodos a la placa de circuito del amplificador.
A continuación, abra el programa de adquisición de datos e inicie la fuente de alimentación a cero milivoltios. Confirme que no se detecta corriente continua entre los electrodos de la celda vacía. Durante esta demostración es importante observar cómo la presión transcapilar puede afectar la formación de membranas y la posterior formación de nanoporos.
Sin realizar estos dos pasos correctamente, los experimentos no funcionarán. Cargue alrededor de un mililitro de electrolito en una jeringa y conéctelo a la línea de fluido conectada al depósito. Añadir electrolito al depósito hasta que la cara del QNM esté sumergida, como indica la corriente iónica entre los electrodos que saturan el amplificador.
Si el amplificador no se satura, desbloje el QNM aplicando una tensión de pop de más o menos voltios o aumentando la presión capilar en unos 300 milímetros de mercurio. Utilice ambas técnicas si es necesario. Una vez que el amplificador se satura, retire el electrolito del depósito hasta que los niveles de solución caigan por debajo del QNM, como indica la corriente que vuelve a cero.
Para comenzar el proceso de formación de la bicaca lipídica, elevar el nivel de solución de electrolitos muy por encima de la cara del QNM y tenga en cuenta la cantidad de solución que tomó. A continuación, sumerja una punta de pipeta de 10 microlitiles en la solución DPHyPC y extraiga todos los lípidos visibles en la punta. Toque la punta de la pipeta a la superficie de la solución de electrolitos y permita que el lípido fluya desde la pipeta a través de la interfaz aire-agua.
Espere de dos a cinco minutos para que el lípido se propague uniformemente a través de la solución. A continuación, retire lentamente el electrolito hasta que la superficie de la solución esté por debajo del QNM y luego agregue lentamente suficiente electrolito para elevar la solución por encima del QNM para formar la membrana bicapa lipídica aislante. Si la bicacapa no se forma después de tres intentos, aplique otra porción de lípidos como se describió anteriormente y repita el proceso.
Una vez que la bicapa parece haberse formado, aumentar la presión al capilar para hacer estallar la bicapa y luego reformarla bajando lentamente y elevando el nivel de solución de la misma manera que antes. Repita este proceso varias veces para asegurarse de que el QNM no está obstruido y se ha formado una bicacapa. A continuación, descongelar una alícuota de proteína alfa de hemolysin sobre hielo o a temperatura ambiente.
Llene el depósito con 250 nanogramos de proteína monomérica alfa hemólica y alrededor de 250 microlitros de agua ultrapura. Luego, aplica un sesgo de 200 a 400 milivoltios para inducir la formación de poros. Para facilitar la formación de poros, aumente la presión capilar de 40 a 200 milímetros de mercurio para expandir la bicaplaca desde el QNM.
Una vez que se forma un nanoporo, reducir el sesgo aplicado a la tensión de medición y reducir la presión a aproximadamente la mitad de la presión de inserción. Para comenzar la prueba, reajuste el voltaje de compensación de CC para asegurarse de que no hay corriente medida cuando el potencial aplicado se establece en cero. A continuación, adquiera un rastro de corriente iónica para un potencial aplicado de 120 a 120 milivoltios negativos en relación con el depósito.
Confirme que no hay contaminantes, que estarían indicados por bloqueos espontáneos de corriente. Agregue de uno a seis microlitros de pH 5,5 solución de racimo POM de dos mililitrolares al depósito. Aplique mediciones de serie temporal de corriente iónica a una tensión aplicada de 120 milivoltios negativos.
El movimiento de moléculas individuales de ácido fosfotúntúnstico aniónico a través del canal alfa hemosalís produjo bloqueos transitorios que disminuyeron la corriente iónica media de poro abierto en aproximadamente un 80%La duración y la corriente de bloqueo están directamente relacionadas con la interacción partícula-poro, lo que permite diferenciar las especies iónicas en histogramas de las relaciones de profundidad de bloqueo relativo. A pH 5,5, se observaron dos picos con relaciones de profundidad de aproximadamente 0,06 y 0,16. Basado en la RMN de fósforo, el pico menor era la especie de fosfotungstate de seis menos y el pico principal era la especie de siete menos.
A pH 7,5, las concentraciones relativas cambiaron a una proporción más alta de las especies de 6 menos a las especies de siete menos. La disminución de 20 veces en los eventos de bloqueo en relación con el pH 5.5 se atribuyó a la degradación de fosfato libre e iones tungstatos. La adaptación de las distribuciones de tiempo de residencia requería múltiples funciones exponenciales, lo que indica múltiples tipos de interacciones partícula-poro dentro de cada especie iónica.
Los tiempos de residencia más cortos en pH 7,5 sugirieron interacciones partículas-poros más débiles que el pH 5.5, de acuerdo con estudios previos que mostraban cambios dependientes del pH en el número relativo de cargas fijas en o cerca del lumen del canal de hemolísina alfa. El agua desionizada de alta pureza es fundamental para esta configuración en particular. Un cartucho de filtro orgánico gastado fue la causa probable de que nuestro laboratorio no pudiera formar membranas en los QNM durante meses.
Individuos nuevos en esta versión particular del método también podrían luchar porque las membranas son tan pequeñas y hay un truco para conseguir nanoporos para formar. Este método, iniciado hace varias décadas, ha demostrado ser útil para analizar iones, ácidos nucleicos y polímeros sintéticos, así como secuenciación de ADN. También podría encontrar aplicaciones en biofísica y biología celular básica.
Por ejemplo, este procedimiento se puede utilizar para estudiar las propiedades físicas de los polímeros sintéticos y biopolímeros para investigar su tamaño, interacciones con otras moléculas y otras preguntas importantes.
