El objetivo general de este método es generar un sistema de expresión dirigida altamente específico para tejidos. En este método, demostramos la generación de un controlador de transcripción binaria específico para nuestro homólogo Drosophila FGF, sin ramificaciones. La expresión dinámica y espaciotemporal de branchless regula la hemogénesis de ramas del epitelio de las vías respiratorias traqueales.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la expresión espaciotemporal y la migración de células productoras sin ramas, se puede aplicar fácilmente a otros genes y tejidos en Drosophila o en otros organismos modelo, como C.Elegans y peces cebra. La principal ventaja de esta técnica es que genera sistemas de expresión altamente confiables, específicos de tejidos y genes, y activos exclusivamente en células donde los elementos reguladores cis del gen reemplazado son funcionales. Los sistemas de transcripción binaria son herramientas esenciales para la expresión y manipulación génica dirigida.
Un activador trans, como GAL4 o LexA, expresado bajo el control de los elementos reguladores cis de un gen, impulsa un gen trans efector que se coloca aguas abajo de sitios específicos de unión a la transcripción, como UAS para GAL4 y/o LexO para LexA. Esta metodología reemplaza el primer exón de codificación del gen sin ramas con el controlador de transcripción. El método basado en CRISPR Cas9 coloca una secuencia de activador trans LexA bajo la regulación endógena del gen sin ramificaciones y, en consecuencia, facilita la expresión del activador trans exclusivamente en patrones espaciotemporales específicos sin ramificaciones.
Comience seleccionando dos sitios de destino de ARN guía que se dirigen específicamente a dos extremos de la región de interés seleccionada. Abra la herramienta de diseño CRISPR de su elección. Fly CRISPR Optimal Target Finder se utiliza aquí.
Haga clic en Seleccionar genoma'insertar la secuencia de interés, y seleccione la anotación más reciente del genoma Drosophila melanogaster, actualmente R subrayado seis, en el menú desplegable. A continuación, haga clic en Seleccionar longitud de guía' y en la entrada 20. Seleccione Todos los objetivos DE CRISPR y haga clic en Buscar objetivos CRISPR.
Evalúe todos los objetivos de ARN de guía candidato estableciendo el máximo para la rigency y NGG only'para PAM. Para generar un vector de expresión de ARN de guía en tándem, primero PCR amplificar un fragmento de ADN para introducir dos secuencias de espaciador de proto en una columna vertebral vectorial de expresión de ARN pCFD4. Utilice una imprimación hacia delante y hacia atrás, cada una con una secuencia de espaciador de proto, y superponga con la secuencia vectorial pCFD4 en un PCR utilizando polimerasa de alta fidelidad y ADN de plantilla pCFD4.
Para preparar pCFD4 para la clonación, digiere el plásmido con la enzima Bbs1. Establecer una reacción en el tampón de digestión adecuado que contenga de dos a cinco microgramos de plásmido pCFD4 y un microlitro de la enzima Bbs1 y un volumen final de 50 microlitros. Mezclar el contenido de la reacción agitando el tubo y recogiendo todas las gotas dispersas de la pared del tubo a la parte inferior por un breve giro.
Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante dos horas después de ejecutar el producto PCR y digerir el plásmido en un gel de agarosa del uno por ciento. Purifique el plásmido lineal de 6,4 pares de kilobases y el producto PCR de par base 600 utilizando columnas de purificación de gel estándar. Configure la reacción del ensamblaje del ADN según el protocolo del fabricante.
Para el knock-in genómico de una secuencia GAL4 o LexA, diseñe un donante HDR de doble cadena que contenga la secuencia del activador trans, flanqueado por dos brazos homológicos. Para evitar la reorientación del ARN guía al locus de ingeniería, diseñe el donante de reemplazo de tal manera que los sitios de reconocimiento de ARN guía se vean interrumpidos por la secuencia exógena introducida. Además, para evitar alterar la pureza de los elementos reguladores cis, seleccione siempre los sitios de reconocimiento de ARN guía dentro de la región de exón de codificación.
Para generar un casete de reemplazo, planifique la estrategia de ensamblaje de ADN para unir cuatro segmentos. Los cinco brazos de homología principal y tres, la secuencia de ADN del activador trans exógeno medio y la columna vertebral del vector de clonación linealizada. PcR amplifican un CASSETTE de expresión GAL4 o LexA a partir de un vector apropiado y PCR amplifican los brazos homológicos del ADN genómico extraído de la línea de mosca principal seleccionada para inyección.
Utilice la polimerasa de alta fidelidad en cada PCR para generar los fragmentos de destino. Para configurar la reacción del ensamblaje de ADN, mezcle el vector de clonación linealizado y los fragmentos de destino generados por la clonación de PCR con la mezcla maestra del ensamblaje de ADN y un volumen de reacción final a 20 microlitros según las instrucciones del fabricante. Incubar la mezcla de reacción durante una hora a 50 grados centígrados.
Cuando los embriones Nos-Cas9 previamente inyectados tanto con el plásmido de la expresión de ARN guía como con el donante de reemplazo, se convierten en adultos, cruzan G0 vuelan individualmente para equilibrar las moscas de una línea apropiada para el alelo objetivo. Anesthetizar la descendencia F1 de cada cruz G0 en una almohadilla de dióxido de carbono. Recoger aleatoriamente de 10 a 20 machos bajo un microscopio estéreo.
Cruce individualmente cada macho seleccionado a una hembra equilibradora de una línea apropiada para el alelo objetivo. Cuando las larvas F2 eclosionen, escoja el padre de la F1 de cada cruz. Extraiga adn genómico aplastando cada mosca durante 10 a 15 segundos con una punta de pipeta, que contiene 50 microlitros de tampón de aplastamiento sin dispensar el tampón.
A continuación, dispensar el tampón restante en el tubo y mezclar bien. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Después de la incubación, colocar los tubos en bloque de calor de 95 grados Celsius durante uno a dos minutos para inactivar la proteinasa K. Después de girar hacia abajo durante cinco minutos a 10.000 veces G, almacenar la preparación en cuatro grados Celsius para el análisis de PCR adicional.
Realice pantallas basadas en PCR de tres pasos utilizando imprimaciones hacia adelante uno e invierta una para examinar la existencia de la inserción o el reemplazo. Realice el PCR usando el adelante dos y invierta dos imprimaciones para verificar la inserción o el reemplazo de las tres regiones principales. Realice PCR utilizando imprimaciones M13F e invierta tres para comprobar ends-in'HDR.
Mantenga las líneas de vuelo con los extremos confirmados'HDR y establezca acciones equilibradas de la generación F2. Cruzar el equilibrador vuela de nuevo para eliminar cualquier mutación no intencionada en otros cromosomas. La expresión sin rama, o bnl, se muestra aquí en rojo en el tercer disco de ala de larvas instar, con las células expresantes sin aliento del receptor, que se muestran en verde, en el creciente sac primordium de aire.
Las células de expresión sin ramificación se muestran aquí en la rama conectiva transversal TR5 y la rama dorsal TR2. Las células traqueales expresantes sin aliento se muestran aquí en verde. Las células liberadoas sin aliento se muestran en verde, marcando la tráquea embrionaria en desarrollo desde la etapa nueve hasta la etapa 14 y las células expresantes sin ramificación se muestran en rojo.
Esta imagen muestra la expresión sin ramificaciones inducida en ubicaciones de tejido ectópico bajo condiciones hipoxiales, en relación con el control. Este método fue diseñado para retener todas las regulaciones espaciotemporales originales de transcripción de genes sin ramificación. Por lo tanto, era importante reemplazar sólo el primer exón de codificación del gen con la secuencia de codificación del activador trans LexA.
Después de su desarrollo, este nuevo conjunto de herramientas genéticas allanó el camino para explorar nuevos patrones de expresión tisular del gen sin ramificaciones. También permitió la expresión errónea del gen y derribó exclusivamente en células expresantes sin ramas y ayudó en el monitoreo de la migración lineal y las interacciones de señalización de las células.
