Como muestra nuestro protocolo, las tecnologías CRISPR CasRx se pueden utilizar para lograr reducciones de transcripción de genes ubicuas y específicas de tejidos en moscas de la fruta. Nuestra técnica ofrece un paquete de inicio para cualquier persona que esté interesada en utilizar la reducción de la transcripción de genes basada en CRISPR en moscas de la fruta, al tiempo que es compatible con una mayor personalización y optimización. Para establecer una orientación de ARN in vivo ubicua utilizando un sistema CasRx de dos componentes, recolecte 10 moscas hembras adultas vírgenes de la línea de interés de ARNg homocigota y cinco moscas macho adultas del heterocigoto equilibrado Ubiq CasRx CurlyO.
Coloque las moscas parentales en un vial suplementado con 100 microgramos de polvo de levadura seca y levante los viales durante 48 horas a 26 grados centígrados. Observe los viales todos los días para ver si alguna nueva progenie adulta ha surgido del pubis de la generación F1 y anestesia a alguno de los adultos con dióxido de carbono durante 10 segundos. Una vez que las moscas se vuelven inmóviles, vacíe el vial en una almohadilla para moscas conectada al tanque de dióxido de carbono con dióxido de carbono continuo y use una cámara a color conectada a un microscopio estéreo fluorescente para calificar e obtener imágenes de los fenotipos de las moscas.
Luego cuente el número de progenie con diferentes fenotipos, de acuerdo con la expresión de la señal fluorescente. Según la genética mendeliana, se espera que el 50% de la progenie exprese el ARN objetivo. Tenga en cuenta que la toxicidad del sistema Ubiq CasRx puede reducir la proporción de progenie que expresa ARN dirigido a menos del 50% Para establecer una orientación ubicua de ARN exógeno in vivo utilizando un sistema CasRx de tres componentes, recolecte de ocho a 10 moscas hembras adultas vírgenes de una línea de expresión de luciferasa dual y de cuatro a cinco moscas macho adultas del heterocigoto equilibrado Ubiq CasRx Curly más TM6, Línea STB que exhibe ojos blancos, alas rizadas y fluorescencia roja ds simultáneamente.
Coloque el paso parental uno cruzado en un vial suplementado con 100 microgramos de polvo de levadura seca y retroceda esta cruz durante 48 horas a 26 grados centígrados. Al final de la incubación, retire todas las moscas parentales de cada vial y devuelva los viales a la incubadora de 26 grados Celsius durante al menos 14 días. En el transcurso de 14 días, como se mencionó anteriormente, recolecte de ocho a 10 vírgenes hembras de la luciferasa homocigota dirigida a la línea de ARNg tres veces.
Observe el paso uno cruza viales todos los días para ver si han surgido nuevas progenies adultas de las pupas, anestesiando con dióxido de carbono para permitir la recolección de cuatro a cinco moscas macho que expresan tanto el Ubiq CasRx como el reportero dual Luciferase según esté disponible. Coloque las moscas en un nuevo vial con 10 hembras vírgenes de la mosca de la fruta luciferasa dirigida a la línea de ARNg, y coloque estos pasos dos cruces a 26 grados centígrados durante 48 horas. Recoja otros cinco machos de un día de edad que expresen tanto el Ubiq CasRx como el reportero de luciferasa dual de los viales cruzados del paso uno e incube las moscas durante dos o cuatro días solos a 26 grados centígrados antes de transferirlas a una centrífuga de 1,5 mililitros para un almacenamiento de menos 80 grados centígrados.
Al final de la incubación, retire todos los viales parentales de cada uno de los viales cruzados del paso dos. Y devuelva los viales a la incubadora de 26 grados centígrados durante al menos 20 días. Observe los viales cruzados de paso dos todos los días para ver si alguna nueva progenie adulta ha emergido del pubis, anestesiando a las moscas con dióxido de carbono a medida que están disponibles, y anotando e imaginando sus fenotipos como se ha demostrado.
La genética mendeliana sugiere que, si todas las moscas son viables, el 25% de la progenie debería expresar el ARN objetivo. Para realizar un ensayo de luciferasa, genere las moscas heterocigotas trans triples, así como las moscas de control como se ha demostrado. Recolectar las moscas macho al nacer y envejecerlas hasta los tres días de edad.
Transfiera las moscas de tres días de edad a tubos centrífugos de 1,5 mililitros y lisarlas usando un tampón en el tampón de lisis de luciferasa de un kit de ensayo de luciferasa disponible comercialmente. Luego use cinco microlitros de tejido lisado de cada muestra y luminómetro para medir tanto las moscas de la fruta como la actividad de la luciferasa, de acuerdo con los protocolos estándar de ensayo de luciferasa. F1, trans heterocigoto CasRx, tiene tasas de supervivencia significativamente más bajas en comparación con las moscas trans heterocigotas dCasRx.
Confirmando la toxicidad del sistema Ubiq CasRx de los tres genes diana, las moscas heterocigotas U6 gRNA Y son inviables y no crecen más allá de la segunda etapa larvaria instar. Las moscas heterocigotas Supervivientes Ubq CasRx y U6 gRNA W, demuestran un fenotipo distintivo de ojos anchos totalmente penetrante. Además, también se observa una reducción significativa de las transcripciones de genes diana para tres genes diana.
También se observa evidencia de actividad fuera del objetivo inducida por CasRx cuando se comparan transcripciones expresadas diferencialmente entre muestras de moscas que expresan CasRx y muestras de moscas que expresan dCasRx. En la cruz de dos pasos, solo la combinación de los tres genes trans da como resultado una letalidad del 100%. Cuando se emplea la orientación de ARN específico del tejido utilizando un diseño de sistema CasRx de tres componentes, el nivel de toxicidad se reduce cuando la expresión general de CasRx se reduce utilizando el promotor UAST en comparación con el promotor Ubiq.
Es importante configurar el proceso genético correctamente utilizando moscas de género correcto y fenotipos correctos.
