Damos las gracias a un fondo interno de la Universidad de Oklahoma (a BZ) y una subvención de la NSF (IOS-1025556, de BZ y RAB) para apoyar a LFR, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, y esta investigación. Una subvención del NIH (SR1 NS060878, a BZ) parcialmente financiado RAB. RAB reconoce un NRSA NIH (NS07292 T32) de entrenamiento subvención concedida a la Universidad de Brandeis, y una subvención del NIH (RO1 GM21473) otorgado a Jeffrey Hall en Brandeis, para apoyar las fases iniciales de este estudio. Damos las gracias a Jeffrey Hall por su aliento constante para este proyecto. Agradecemos al Dr. Kristin Scott para que nos proporciona la bañera P&gt; GAL80 cepa&gt;.

1. Drosophila cepas <ol><li> Gal4 conductor: GMR-Gal4, que expresa Gal4 en las células fotorreceptoras. </li><li> UAS líneas UAS-MJD78Q (o UAS-polyQ), que causa la degeneración neuronal en las células que expresan Gal4. UAS-GFP, que expresa GFP en células que expresan Gal4. </li><li> FLP líneas ey-FLP, que expresa FLP en los fotorreceptores y en los subgrupos de regiones del cerebro. ET-FLPx2 líneas, que son potenciador trampa de las líneas que contienen dos copias del FLP (FLP-IRES-FLP). Hemos generado ~ 1000 ET-FLP líneas (Bohm et al., 2010), cuyos patrones de expresión aún no se han caracterizado. Aquí se describe la caracterización del patrón de expresión de seleccionar ET-FLPx2 en la mosca de larvas y adultos del sistema nervioso central (SNC). </li><li> FLP reportero yw, la actina P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP (Pignoni y Zipursky, 1997), que depende del patrón de expresión de ET-FLPx2 a través de actina P&gt; Gal4, UAS-GFP a FLP mediada por recombinación de la escisión&gt; CD2. </li><li> Dos complementarios GAL80 de conversión de las herramientas Bañera P&gt; GAL80&gt; (Gordon y Scott, 2009), la construcción plegable, que expresa constitutivamente en todos los tejidos GAL80 impulsado por un promotor de la tubulina fuerte. Al FLP mediada por recombinación,&gt; GAL80 se voltea hacia fuera y GAL80 expresión termina sólo en ET-FLPx2 que expresan los tejidos. Bañera P&gt; detener&gt; GAL80 (Bohm et al., 2010), el flip-en construcción, que no expresa GAL80 en condiciones normales. GAL80 expresión es activada por el promotor de la tubulina sólo en ET-FLPx2 que expresan los tejidos en los que se da vuelta FLP parar&gt; y gira en GAL80. </li><li> Las moscas para las pruebas de la actividad FLP en el ojo compuesto GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; detener&gt; GAL80 (Bohm et al, 2010.), Que ha degenerado y los ojos sin pigmento. En FLP-que expresan las células fotorreceptoras, la expresión polyQ se apaga después de GAL80 flip-en. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) bañera P&gt; GAL80&gt;, que tiene los ojos normales. En FLP-que expresan las células fotorreceptoras, la expresión polyQ se activa después de GAL80 plegable. </li></ol> 2. Reactivos Tampón fosfato salino (PBS, 1X), pH 7,4. 4% de paraformaldehído (PFA), diluido en PBS a partir de 16% de PFA, EM de grado (Cat # 15710, Ciencias de la microscopía electrónica, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS contiene 0,1% de Triton X-100 (Sigma) Anti-Elav (MAB, 9F8A9; hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, de la Universidad de Iowa), las manchas de todas las neuronas de Drosophila. Anti-Repo (MAB 8D12; Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma de la Universidad de Iowa) tiñe las células gliales en Drosophila. Alexa 594 pollos contra anticuerpo secundario del ratón (Invitrogen) 3. Mapeo de los patrones de expresión de potenciador trampa líneas FLPx2 (* pasos críticos) <ol><li> Recoge las hembras vírgenes de la yw, la actina P&gt; CD2&gt; Gal4; línea UAS-GFP y cruz para los machos de cada uno de ET-FLPx2 líneas. El primero sirve como un reportero GFP para la expresión del tejido de la ET-FLP. </li><li> * Disección de vagar 3 º estadio las larvas de F1, mantener el sistema nervioso central (es decir, el cerebro y el cordón nervioso ventral, VNC) y la pared del cuerpo, fijar durante 1 hora en PFA al 4% en el hielo, lavar 3 veces con helado de PBS, seguido de se lava 3 veces con PBT. Disección <ol><li> Quitar vagando 3 º estadio las larvas de F1 y colocarlos en un recipiente limpio plato Sylgard (35 mm x 10 mm placa de Petri llenas de 2 gramos de Sylgard - mezclado de acuerdo a las instrucciones de fabricación). <ol><li> Eliminar los restos de comida con pincel </li></ol></li><li> Llenar el plato con helado de 1XPBS y el lugar en el hielo para anestesiar a las larvas </li><li> Sujete los ganchos de la boca de una larva con un par de pinzas y agarre la cutícula se extiende cerca del espiráculo anterior con otro par de pinzas y la cáscara de la cutícula hacia el extremo posterior. El CNS se adjuntará a la boca a lo largo de los ganchos con las glándulas salivales, intestino, y los discos imaginal. </li><li> Retire el exceso de tejido y discos imaginales que rodean el sistema nervioso central. </li><li> Transferir el sistema nervioso central en una PBS-3 y plato lleno de pyrex. <ol><li> A siliconado P200 punta de la pipeta se puede utilizar para evitar que se seque el tejido. </li></ol></li><li> Fix durante 1 hora en 200 l de PFA al 4% en el hielo. <ol><li> Asegúrese de que el SNC está completamente sumergida en la PFA. <ol><li> Si el sistema nervioso central flota, esto normalmente indica que el sistema nervioso central no se limpia adecuadamente en el tejido circundante. </li></ol></li></ol></li><li> Lave 3 veces con helado de PBS seguido de lavados 3 veces con PBT. </li></ol></li><li> * Disección del sistema nervioso central de las moscas adultas F1. <ol><li> Anestesiar a las moscas con CO 2 o el lugar de las moscas contenido dentro de un frasco vacío en hielo durante 10 minutos. </li><li> Adultos a cabo las moscas en un recipiente de vidrio un 95% EtOH llena de hielo durante 30 segundos. </li><li> Transferencia de las moscas adultas en un recipiente de vidrio lleno de 1XPBS en el hielo. <ol><li> Lave 3 veces con helado de 1X PBS para eliminar EtOH residual </li></ol></li><li> Coloque una mosca en un Sylga 35 mmº plato lleno con helado de PBS 1X </li><li> Coloque el lado ventral hacia arriba e inserte un lápiz pequeño insecto (pins minutiens 0,1 mm) a mitad del abdomen. <ol><li> Con un par de pinzas de mantener la base de las piernas y eliminar las piernas con otro par de pinzas. </li></ol></li><li> Eliminar la cutícula cabeza <ol><li> Mientras que agarrar la trompa con un par de pinzas, coloque otra debajo del ojo y la piel de la cutícula hacia la línea media dorsal de la cabeza de mosca. </li><li> Coge el otro ojo y eliminar la cutícula que queda en el otro lado. </li><li> El uso de pinzas afiladas y / o una aguja de tungsteno afilado, retirar el tejido traqueal que rodean el cerebro <ol><li> La limpieza inadecuada de la tráquea se traducirá en una fuerte auto-fluorescencia, obstruyendo la expresión de GFP, y permiten que el cerebro flotando en la fijación de </li></ol></li></ol></li><li> VNC Disección <ol><li> Eliminar la cutícula dorsal <ol><li> Comenzando en el extremo posterior del tórax, colocar dos pinzas en cada lado de la preepisternum 3 º (es decir, tomando la base de las patas traseras). </li><li> Separe cuidadosamente la cutícula de distancia de la línea de la línea media ventral, repita este hasta llegar a la base del cuello. </li><li> Suavemente separa las dos mitades de la cutícula dorsal exponiendo el VNC </li></ol></li><li> A continuación, retire el abdomen del tórax. Mientras que con un par de pinzas para sostener el tórax en la base segunda etapa, el uso de otro par de pinzas para agarrar el abdomen, cerca del esternito abdominal primero y tire el abdomen fuera. </li><li> Para quitar el VNC del tejido circundante torácica. Mantenga el área del húmero con un par de pinzas y con otro par de pinzas suaves lágrimas de distancia de la mayoría de la canal torácico. </li><li> En este punto no debe ser un anillo de tejido conectivo que rodea a la conectivo cervical (cuello). El uso de dos pinzas de romper el anillo de distancia. </li><li> Elimine cualquier exceso de tejido que rodea el tórax VNC </li></ol></li><li> Transferir el cerebro y VNC a 9-así plato Pyrex contiene 1X PBS sobre hielo <ol><li> A siliconado P200 punta de la pipeta se puede utilizar para evitar que se seque el tejido </li></ol></li></ol></li><li> * Fijar el sistema nervioso central adulto durante 1 hora en PFA al 4% en el hielo y lavar 3 veces con PBS helado y 3 veces con PBT. </li><li> Incubar la preparación del SNC adulto o el sistema nervioso central y la pared del cuerpo de las larvas a 4 ° C durante la noche con anticuerpos frente a cualquiera de las neuronas (anti-Elav, 1:10) o glía (anti-Repo. 1:10). Lavar la preparación 5X con PBT. </li><li> Incubar con la preparación de adultos o larvas con Alexa 594 pollos contra anticuerpos secundario del ratón (1:100) a temperatura ambiente durante 2 horas, y lavar la preparación con PBS. </li><li> Montar el sistema nervioso central larvas o adultos en una diapositiva. Para preservar la forma natural del sistema nervioso central, use un anillo de plástico en forma de O (Etiqueta de refuerzo claro, Avery Dennison, Productos de oficina, Brea, CA) en la diapositiva como un puente de mini a suspender la hoja de la cubierta. </li><li> Examine la preparación de los patrones de expresión GFP y Elav (o fuera de subasta) bajo un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 4. La aplicación de dos complementarios GAL80 de conversión de las herramientas de la represión Gal4 en los fotorreceptores <ol><li> Voltear GAL80 cabo a través de bañera P&gt; GAL80&gt; (Figura 5). <ol><li> Recoge los hombres de la GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; GAL80 línea&gt;. Tenga en cuenta que los ojos compuestos son normales en estas moscas. </li><li> Mate con vírgenes FLP-ey. </li><li> Recoger las moscas F1 y examinar el fenotipo del ojo. </li></ol></li><li> Mover de un tirón a través de GAL80 en bañera P&gt; detener&gt; GAL80 (Figura 5). <ol><li> Recoger GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; detener&gt; GAL80 moscas macho y examinar el fenotipo del ojo. Tenga en cuenta los degenerados y los ojos sin pigmento en estas moscas en comparación con las cepas de tipo salvaje (Cantón-S) </li><li> Mate con vírgenes FLP-ey; </li><li> Recoger las moscas F1 y examinar el fenotipo del ojo. </li></ol></li><li> Seleccione ET-FLPx2 líneas de expresión en las células fotorreceptoras </li></ol> Pasos 4.1 y 4.2 se puede repetir con ET-FLPx2 líneas que expresan FLP en un subconjunto de las células fotorreceptoras. Por otra parte, ya sea el GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; detener&gt; GAL80 moscas o el GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; GAL80&gt; moscas se puede cruzar a la persona ET-FLPx2 líneas para la detección de las líneas que expresan FLP en las células fotorreceptoras. Valiosa ET-FLPx2 líneas son las que expresan sólo en un subgrupo de FLP o de un solo fotorreceptor (Figura 6). 5. Los resultados representativos El patrón de expresión de un determinado ET-FLPx2 línea puede ser fácilmente examinados y documentados en la F1 larvas o moscas adultas derivadas de la cruza entre yw, la actina P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP vírgenes y ET-FLPx2 los hombres (Figura 1) . Por lo general, de tres a cinco réplicas de los animales F1, se disecan y se examina para determinar la reproducibilidad del patrón de expresión de FLP (Bohm et al., 2010). <stRong&gt; La figura 2 muestra el patrón de expresión de FLP en ET-173A FLPx2 línea en el SNC de larvas y adultos. El patrón de FLP pueden ser analizados usando un marcador neuronal o glial (Figura 3 y 4). Los resultados mostrados en la Figura 7 ilustran la eficacia de los flip-GAL80 y flip-sistemas de producción en la represión intersectorial de Gal4 siguientes FLP mediada por recombinación. La bañera P&gt; detener&gt; GAL80 construcción no parece haber ninguna fuga de expresión GAL80 (sobre la base de la degeneración uniforme y despigmentación de los fotorreceptores), y sin embargo es 100% efectiva para mover de un tirón en GAL80 con la ayuda de eyFLP para reprimir GMR- Gal4 y restaurar la vista a la apariencia normal (Fig. 7A). Por el contrario, bañera P&gt; GAL80&gt; completamente reprime GMR-Gal4 antes de la introducción de eyFLP. Después de GAL80 plegable, GMR-Gal4 unidades UAS-polyQ expresión, lo que lleva a degenerar y los ojos sin pigmento (Fig. 7B). En este ejemplo, usamos un pan-FLP photorecetor al mapa &#39;circuitos&#39; el fotorreceptor pero no examinó las consecuencias del comportamiento. Utilizando enfoques similares con comportamiento relevante Gal4 líneas, trazamos parte de la CCAP-Gal4 circuito de regulación de la expansión del ala de las moscas adultas (Bohm et al., 2010). Creemos que el método FINGR será muy útil para ayudar a nuestra comprensión de las bases neuronales del comportamiento. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. . Examinar el patrón de expresión de una ET-line FLPx2 El patrón de expresión de FLP (óvalos azules) de una línea de ET-FLPx2 puede ser determinada por el cruce de una ET-FLPx2 masculino (arriba a la izquierda) con una actina P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS- GFP virgen (superior derecha). Omnipresente actina P&gt; Gal4 expresión en la mujer se ve obstaculizado por los padres de la inserción de la FRT (triángulos de color gris), flanqueada secuencia CD2. En la descendencia F1, FLP especial la secuencia CD2, lo que permite actina P&gt; Gal4 para conducir UAS-GFP expresión. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Patrón de expresión de una línea de ET-FLPx2 en larvas y adultos del sistema nervioso central. Estas imágenes muestran el sistema nervioso central (cerebro y nervios ventral, VNC) disecados de la descendencia producida a partir de apareamiento yw, la actina P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS-GFP a los padres a la ET-173A FLPx2 línea. Por recombinación de los&gt; CD2 casete&gt;, FLP activa actina P&gt; GAL4 expresión (la expresión consecuente de la UAS-GFP). Por lo tanto, el patrón de las buenas prácticas agrarias informes FLP-que expresan las células. El panel A muestra el patrón de expresión de FLP larvas, mientras que el panel B muestra el patrón de expresión para adultos en línea 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Caracterización de los tipos de células que expresan flippase en ET-FLPx2 línea # 688A. A, Una imagen compuesta de un fijo F1 larva 3 º estadio teñidas con anti-REPO de un cruce entre ET-FLPx2 línea # 688A y una línea de GFP Flippase presentación de informes. BD, un gran aumento (Zeiss Plan-Apochromat 63x aceite) vista tomada desde el extremo posterior de un VNC desde las larvas 3 de estadio. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Caracterización de los tipos de células dentro del cuerpo de hongo de la ET-FLPx2 línea # 150. AC, una imagen de gran aumento (63x de inmersión en aceite) del cuerpo de setas en un fijo larva F1 3er estadio teñidas con anti-REPO. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Ilustración de la GAL80 Estrategias Flip-y Despliegue. A. En la estrategia plegable, tubulina promotor impulsado GAL80 (Tina P&gt; GAL80&gt;) es constitutivamente activa, lo que resulta en la represión de GMR-Gal4 y un fenotipo de ojo de tipo salvaje (ojos rojos). Esta represión se elimina mediante la introducción de FLP (morado), que le dará la vuelta GAL80 a cabo (en el centro, rojo) y permite GMR-Gal4 para conducir UAS-polyQ expresión. Esto se traduce en la degeneración de las células fotorreceptoras (ilustrado por los puntos blancos en el ojo). B. En el recíproco de la estrategia anterior, la tubulina promotor impulsado GAL80 expresión se ve interrumpida por FRT (gris triángulo) flanqueado &quot;stop&quot; codón. En ausencia de GAL80, GMR-Gal4 se une a UAS-polyQ causando la degeneración neuronal en los fotorreceptores (ilustrado por los puntos blancos en el ojo). Al cruzar el GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; detener&gt; GAL80 machos con hembras vírgenes que expresan FLP en las células fotorreceptoras, FLP (púrpura) se catalizan la recombinación en los sitios FRT, extirpando el &quot;stop&quot; codón (en el centro, rojo), lo que permite GAL80 expresión y la represión de la GMR-GAL4. Esta reserva la neurodegeneración en las células fotorreceptoras (ilustrado por la falta de wHite puntos en el ojo). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. La aplicación del método FINGR en mover de un tirón GAL80 a cabo con ET-FLPx2 línea # 688A progenie F1 de un cruce entre ET-FLPx2 línea # 688A virgen de GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 masculino. La falta de pigmento en el medio de la omatidios ojo representa la expresión de FLP en la línea # 688A. En esta zona GAL80 supresión de GMR-Gal4 fue relevado permitiendo que el Gal4 para conducir UAS-polyQ. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. La aplicación del método FINGR en mover de un tirón GAL80 dentro o fuera de Gal4 cruzan en los fotorreceptores. A. La bañera P&gt; detener&gt; GAL80 flip-en el sistema restringe GAL4 expresión en una forma dependiente de FLP. En GMR-Gal4, UAS-polyQ, bañera P&gt; detener&gt; GAL80 moscas, las células fotorreceptoras se degeneran y despigmentadas (mosca de la izquierda). Tras la introducción de eyFLP, GAL80 se expresa en las células fotorreceptoras, que resulta en la represión total de GMR-Gal4, que a su vez se apaga el polyQ expresión y produce moscas con ojos normales (mosca de la derecha). B. La bañera P&gt; GAL80&gt; tirón Salida sistema funciona de la manera opuesta a la bañera P&gt; detener&gt; GAL80 flip-en el sistema. Bañera P&gt; GAL80&gt; constitutivamente GAL4 reprime y reprime la expresión de polyQ (izquierda volar, con los ojos normales). Tras la introducción de eyFLP, GAL80 se voltea hacia fuera de las células fotorreceptoras, el alivio de la supresión de la GMR-Gal4 y encender la polyQ expresión. Esto lleva a las moscas con ojos de degenerado y despigmentadas (mosca de la derecha).

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El sistema GAL4/UAS ha sido ampliamente utilizado con éxito y por Drosophilists de varios estudios biológicos (Marca y Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Hasta la fecha, la comunidad de la mosca ha generado miles de promotor impulsado y potenciador de las líneas Gal4 trampa. Una de las principales del método FINGR es que es compatible con el sistema GAL4/UAS, lo que permite ampliar significativamente el poder de Gal4 en los estudios de Drosophila. Una aplicación importante del método es FINGR a los circuitos neurales que subyacen a ajustar la conducta a través Gal4/Gal80 intersección. Estos comportamientos pueden incluir, pero no se limitan a, el aprendizaje y la memoria, el cortejo, el sueño y el ritmo circadiano. El método FINGR también puede ser utilizado para asignar las neuronas críticos que son propensos a la neurodegeneración en la modelización de enfermedades neurodegenerativas humanas como el Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de Parkinson. Del mismo modo, los focos de las neuronas o circuitos neuronales esenciales para la cocaína de mediación, el alcohol y la adicción a otras sustancias pueden ser asignadas mediante el método FINGR. Cabe señalar que Gal4s condicional (Osterwalder et al, 2001;.. Romana et al, 2001) podría ser utilizado con el método FINGR con el fin de obtener el control temporal de los circuitos neuronales y sus comportamientos. Modificación de la GAL80 convertidora de herramientas mediante un GAL80 sensibles a la temperatura (ts GAL80, McGuire et al., 2003) puede producir bañera P&gt; detener&gt; GAL80 ts o bañera P&gt; GAL80 ts&gt;, añadiendo flexibilidad adicional temporal en la manipulación del circuito. Más allá del sistema nervioso, el método FINGR es igualmente aplicable a la restricción de Gal4 expresión en los subconjuntos de células ya sea el ala o la pierna. Las líneas de ET-FLPx2 será un recurso valioso para todos los biólogos interesados ​​en Drosophila FRT / FLP basado en el análisis clonal (Xu y Rubin, 1993), incluyendo MARCM (Lee y Luo, 1999). También se espera que algunas ET-FLPx2 líneas pueden reemplazar choque térmico-FLP para la producción de clones y reproducible para repetir los análisis morfológicos y de comportamiento. Como potenciador de la trampa Gal4 líneas, la mayoría de ET-FLPx2 líneas es probable que se expresa específicamente en las células de su interés. La mayoría de las líneas se expresa FLP en las células de interés y en otras células o tejidos así. Sin embargo, la falta de &quot;la especificidad tisular de ambas Gal4 y ET FLPx2-no será una preocupación importante para el método de FINGR mientras su región de superposición es deseable para un experimento particular. FINGR está diseñado para convertir dos &#39;grandes&#39; sistemas en una refinada. Los métodos se muestra en estos protocolos son bastante estándar y deben ser reproducibles. Los principales pasos de advertencia que requieren atención de uno son la selección y el uso del fijador. Otros fijadores de PFA se debe evitar debido a que se apague la señal de las buenas prácticas agrarias. También hemos observado que el plato de la disección no debe ser utilizado para la fijación de PFA para evitar la posibilidad de que la expresión de FLP no se de buena tinta por las buenas prácticas agrarias.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

El método binario Gal4 / UAS es de gran alcance para el gen y la manipulación de los circuitos neuronales de Drosophila. Para la mayoría de los estudios neurobiológicos, sin embargo, rara vez se Gal4 expresión específica de tejido suficiente para permitir la correlación exacta de los circuitos con indicadores de comportamiento. Para superar este obstáculo, hemos desarrollado recientemente el método FINGR para lograr una más restrictiva Gal4 expresión en el tejido de interés. El método FINGR tiene tres componentes: 1) el sistema GAL4/UAS tradicionales, 2) un conjunto de FLP / FRT mediada GAL80 herramientas de conversión, y 3) potenciador trampa FLP (ET-FLP). Gal4 se utiliza para definir los circuitos neuronales primarias de interés. Comparando los Gal4 UAS con un efector, tal como UAS-MJD78Q o ts UAS-Shi, regula la actividad neuronal, que es a su vez, se manifiesta por alteraciones en el comportamiento de las moscas. Con un adicional de UAS-periodista como UAS-GFP, el circuito neural involucrado en la conducta específica puede ser al mismo tiempo asignado para el análisis morfológico. Para Gal4 líneas con amplia expresión, Gal4 expresión puede ser restringida por el uso de dos complementarios GAL80 convertidora de herramientas: bañera P&gt; GAL80&gt; (&quot;flip out&quot;) y la bañera P&gt; detener&gt; GAL80 (&quot;flip en &#39;). Finalmente, los investigadores pueden a su vez GAL80 o desactivar, respectivamente, con la ayuda de tejidos específicos ET-FLP. En el flip-en el modo, GAL80 reprimirá Gal4 expresión siempre que sea Gal4 y ET-FLP se cruzan. En el modo de tapa-out, GAL80 aliviará Gal4 la represión en las células en las que se superponen Gal4 y FLP. Ambos enfoques permiten la restricción del número de células en el circuito de Gal4 definido, pero en un patrón inverso. El método FINGR es compatible con una amplia colección de Gal4 líneas en la comunidad de la mosca y de gran versatilidad para el análisis clonal tradicionales y para la asignación de circuitos neuronales. En este protocolo, se demuestra la correlación de patrones de expresión de FLP de seleccionar ET-FLPx2 líneas y la eficacia del método FINGR en las células fotorreceptoras. El principio del método FINGR también debe ser aplicable a otros organismos modelo genético en el cual GAL4/UAS, GAL80 y FLP / FRT se utilizan.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Se describe un Flippase inducida intersectorial Gal80/Gal4 represión (FINGR) método, permitiendo al tejido-específica para determinar FLP GAL80 patrones de expresión. Siempre que sea Gal4 y la superposición de FLP, Gal4 expresión es activada (GAL80 un tirón hacia fuera) o desactivar (GAL80 volcó en). El método FINGR es versátil para el análisis clonal y la asignación de circuitos neuronales.

La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K vistas.  University of Oklahoma - Norman. Se describe un Flippase inducida intersectorial Gal80/Gal4 represión (FINGR) método, permitiendo al tejido-específica para determinar FLP GAL80 patrones de expresión. Siempre que sea Gal4 y la superposición de FLP, Gal4 expresión es activada (GAL80 un tirón hacia fuera) o desactivar (GAL80 volcó en). El método FINGR es versátil para el análisis clonal y la asignación de circuitos neuronales.

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto olfativa Choque Aprendizaje

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imágenes funcionales de la corteza auditiva en los gatos adultos el uso de alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Adquisición de vídeo de alta calidad digital de<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamientos larvas y adultos desde una perspectiva lateral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamiento de las larvas de arrastre

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...