Este método puede ayudar a proporcionar información clave en el campo de la oncología, como la identificación de genes diana putativa y mecanismos patógenos para desarrollar posibles intervenciones terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede detectar la interacción de NFAT2 y otros factores de transcripción con genes diana conocidos y novedosos. Generalmente los individuos nuevos en este método lucharán porque las condiciones óptimas de fijación y cizallamiento son difíciles de establecer.
Para comenzar a llenar un tubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 37%formaldehído. A continuación, llene otro tubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 1,25 de glicina molar en un tubo de cinco mililitros con cuatro mililitros de PBS. A continuación, después de la estimulación de las células girar las células de acuerdo con el protocolo de texto, y volver a suspender las células en 500 microlitros de PBS y colocar el tubo en una caja llena de hielo.
Añadir 13,5 microlitros de 37% formaldehído a las células y mezclar por pipeteo arriba y abajo. A continuación, incubar la suspensión a temperatura ambiente. Después de esto, añadir 57 microlitros de 1.25 glicina molar para detener la fijación.
Y deje que la suspensión se incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Inmediatamente después del período de incubación coloque las células sobre hielo y centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Entonces aspira el sobrenadante.
A continuación, lave las células dos veces con un mililitro de PBS helado a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retire el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de licesis uno por pipetear arriba y abajo. Luego ponga las muestras en hielo e incubarlas con agitación durante 10 minutos.
Después de esto, centrifugar los tubos a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, utilice una pipeta para quitar cuidadosamente el sobrenadante. Homogeneizar las células en cinco mililitros de tampón de lysis dos y pipeta arriba y abajo para mezclar.
Luego incubar las células sobre hielo durante 10 minutos con temblores. Después del período de incubación centrifugar los tubos a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, resuspender el gránulo celular en el tampón de cizalla uno con inhibidor de la proteasa 1X.
Luego incubar la suspensión celular sobre hielo durante 10 minutos. Transfiera 140 microlitros de la suspensión celular a tubos sonicadores teniendo cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. Coloque los tubos en un ultrasonido focalizado a siete grados Celsius y cizallar durante 10 a siete minutos y 1/2 minutos.
Transfiera la suspensión celular a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar las muestras a 15,700 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En primer lugar, prepare 20 microlitros de cuentas recubiertas de proteína A para cada precipitación en un tubo de 1,5 mililitros.
Deje que las perlas se asienten en un bastidor magnético durante un minuto, y retire el sobrenadante. A continuación, lave las perlas con 40 microlitros de tampón de chip 1X uno por cada 20 microlitros de cuentas recubiertas de proteína A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Deje que las perlas se asienten en un bastidor magnético durante un minuto y retire el sobrenadante.
Repita este proceso de lavado tres veces más antes de volver a suspender las perlas en su volumen original de 1X chIP buffer uno. Agregue el inhibidor de la proteasa BSA, el tampón chIP 5X y el agua de grado ChIP-seq a las perlas. A continuación, agregue la cromatina cizallada.
Utilice 10 microgramos de anticuerpos anti-NFAT2 para capturar NFAT2, y 2,5 microgramos de anticuerpos IgG como control. Incubar las mezclas durante la noche a cuatro grados centígrados en una rueda girando a seis RPM. Al día siguiente gire los tubos durante cinco segundos a 7.000 veces G e incubarlos en el bastidor magnético durante un minuto.
A continuación, aspirar el sobrenadante y lavar las cuentas una vez con los tampones de lavado uno, dos, tres y cuatro consecutivamente. Gire los tubos durante cinco segundos a 7000 veces G antes de incubar los tubos en el bastidor magnético durante un minuto. Después de esto, retire el sobrenadante y agregue el siguiente búfer de lavado.
Después del último lavado, gire los tubos durante cinco segundos a 7000 veces G.Incubar los tubos en el bastidor magnético durante un minuto. Retire el sobrenadante y tome las perlas en 100 microlitros de la tampone de elución uno. A continuación, incubar los tubos de la rueda giratoria durante 30 minutos.
A continuación, gire brevemente los tubos y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y agregue cuatro microlitros de búfer de elución dos. Para crear el control de entrada, mezcle un microlitro de la cromatina cizallada con 99 microlitros de tampón de elución uno y cuatro microlitros de búfer de elución dos.
Luego incubar las muestras durante cuatro horas a 65 grados Celsius con temblor. Después de esto, añadir 100 microlitros de 100%isopropanol a los tubos. Vórtice y gire las muestras durante cinco segundos a 7000 veces G.Then agregue 10 microlitros de cuentas magnéticas a cada muestra.
Vórtice e incubar las muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, gire los tubos brevemente y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado uno.
Invierta los tubos para mezclarlos e incubarlos durante cinco minutos en una rueda giratoria a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar brevemente los tubos. Colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto y use una pipeta para quitar el sobrenadante.
A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de lavado dos. Invierta los tubos para mezclarlos e incubarlos durante cinco minutos en una rueda giratoria a temperatura ambiente. Después de esto, centrifuga brevemente los tubos y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto.
Retire el tampón de lavado dos a través de la aspiración y resusppend las perlas en 55 microlitros de tampón de elución. Para eluir el ADN precipitado incubar las muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de esto, gire los tubos brevemente y colóquelos en un bastidor magnético durante un minuto.
Por último, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Este protocolo se realizó por primera vez con células Jurkat analizando LCK como un objetivo NFAT2 potencial. Como se muestra aquí, los resultados óptimos fueron documentados por un enriquecimiento significativo del control positivo IL-2 y el ADN LCK.
La cizalladura subóptima o la falta de fijación pueden conducir a ADN de mala calidad. Finalmente, este protocolo se realizó con células CLL humanas primarias con CD40L que sirven como el control positivo y LCK como objetivo experimental. Como lo demuestra el fuerte enriquecimiento del ADN LCK, LCK es un objetivo directo de NFAT2 en células CLL humanas primarias.
El cizallamiento inadecuado que resulta en ADN de mala calidad puede devolver resultados subóptimos. Al intentar este procedimiento es importante recordar que los pasos de fijación y sonicación son cruciales para el éxito de este método y podrían tener que ajustarse a las células que se están analizando.
