Cette méthode peut aider à fournir des informations clés dans le domaine de l’oncologie telles que l’identification des gènes cibles putatifs et des mécanismes pathogènes pour développer des interventions thérapeutiques potentielles. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut détecter l’interaction de NFAT2 et d’autres facteurs de transcription avec des gènes cibles connus et nouveaux. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que les conditions optimales de fixation et de cisaillement sont difficiles à établir.
Pour commencer à remplir un tube de 1,5 millilitre avec un millilitre de formaldéhyde de 37%. Remplissez ensuite un autre tube de 1,5 millilitre d’un millilitre de 1,25 glycine molaire dans un tube de cinq millilitres avec quatre millilitres de PBS. Ensuite, après la stimulation des cellules tourner les cellules selon le protocole de texte, et re-suspendre les cellules dans 500 microlitres de PBS et placer le tube dans une boîte remplie de glace.
Ajouter 13,5 microlitres de formaldéhyde à 37% aux cellules et mélanger en pipetting de haut en bas. Puis incuber la suspension à température ambiante. Après cela, ajouter 57 microlitres de 1,25 glycine molaire pour arrêter la fixation.
Et laisser la suspension couver à température ambiante pendant cinq minutes. Immédiatement après la période d’incubation placer les cellules sur la glace et centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Puis aspirer le surnatant.
Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS glacé à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirez le supernatant. Resuspendez la pastille cellulaire en cinq millilitres de tampon de lyse un en pipetting de haut en bas. Ensuite, mettez les échantillons sur la glace et incubez-les avec des secousses pendant 10 minutes.
Après cela, centrifuger les tubes à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez une pipette pour enlever soigneusement le surnatant. Homogénéiser les cellules en cinq millilitres de lyse tampon deux et pipette de haut en bas pour mélanger.
Puis incuber les cellules sur la glace pendant 10 minutes avec des secousses. Après la période d’incubation centrifugeuse les tubes à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et retirer soigneusement le supernatant. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire dans le cisaillement tampon un avec inhibiteur de la protéase 1X.
Ensuite, incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 minutes. Transférer 140 microlitres de la suspension cellulaire vers des tubes sonicateurs en prenant soin d’éviter de former des bulles d’air. Placez les tubes dans un ultrasonicateur focalisée à sept degrés Celsius et cisaillez pendant 10 à sept et 1/2 minutes.
Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez les échantillons à 15 700 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et recueillez le supernatant dans un nouveau tube. Tout d’abord, préparez 20 microlitres de perles enrobées de protéines A pour chaque précipitation dans un tube de 1,5 millilitre.
Laissez les perles s’installer sur un support magnétique pendant une minute et retirez le surnatant. Ensuite, lavez les perles avec 40 microlitres de tampon à puce 1X pour chaque 20 microlitres de perles enrobées de protéines A en pipetting de haut en bas. Laisser les perles s’installer sur une grille magnétique pendant une minute et retirer le surnatant.
Répétez ce processus de lavage trois fois de plus avant de suspendre à nouveau les perles dans leur volume d’origine de 1X chIP tampon un. Ajouter l’inhibiteur de la protéase BSA, le tampon chIP de 5 X et l’eau de qualité ChIP-seq aux perles. Ensuite, ajoutez la chromatine cisaillée.
Utilisez 10 microgrammes d’anticorps anti-NFAT2 pour capturer NFAT2, et 2,5 microgrammes d’anticorps IgG comme un contrôle. Incuber les mélanges pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur une roue tournant à six vitesses. Le lendemain, faites tourner les tubes pendant cinq secondes à 7000 fois G et incubez-les sur le rack magnétique pendant une minute.
Ensuite, aspirez le surnatant et lavez les perles une fois avec des tampons de lavage un, deux, trois et quatre consécutifs. Faites tourner les tubes pendant cinq secondes à 7000 fois G avant d’incuber les tubes sur la grille magnétique pendant une minute. Après cela, retirez le supernatant et ajoutez le tampon de lavage suivant.
Après le dernier lavage, faire tourner les tubes pendant cinq secondes à 7000 fois G.Incuber les tubes sur la grille magnétique pendant une minute. Retirer le supernatant et prendre les perles dans 100 microlitres de tampon d’élitution un. Puis incuber les tubes sur la roue rotative pendant 30 minutes.
Ensuite, tournez brièvement les tubes et placez-les sur un support magnétique pendant une minute. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajouter quatre microlitres de tampon d’élitution deux. Pour créer le mélange de contrôle des entrées, un microlitre de la chromatine cisaillée avec 99 microlitres de tampon d’élitution un et quatre microlitres de tampon d’élitution deux.
Puis incuber les échantillons pendant quatre heures à 65 degrés Celsius avec des secousses. Après cela, ajouter 100 microlitres de 100% isopropanol aux tubes. Vortex et faire tourner les échantillons pendant cinq secondes à 7000 fois G.Puis ajouter 10 microlitres de perles magnétiques à chaque échantillon.
Vortex et incuber les échantillons sur une roue rotative à température ambiante pendant une heure. Ensuite, tournez brièvement les tubes et placez-les sur un support magnétique pendant une minute. Aspirez le supernatant et réutilisez les perles dans 100 microlitres de tampon de lavage.
Inverser les tubes pour les mélanger et les incuber pendant cinq minutes sur une roue rotative à température ambiante. Ensuite, centrifuger brièvement les tubes. Placez-les dans un support magnétique pendant une minute, et utilisez une pipette pour enlever le surnatant.
Ajouter ensuite 100 microlitres de tampon de lavage deux. Inverser les tubes pour les mélanger et les incuber pendant cinq minutes sur une roue rotative à température ambiante. Après cela, centrifugez brièvement les tubes et placez-les dans un support magnétique pendant une minute.
Retirez le tampon de lavage deux par aspiration et resuspendez les perles dans 55 microlitres de tampon d’élitution. Pour élucider l’ADN précipité, incuber les échantillons dans une roue rotative à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, tournez brièvement les tubes et placez-les dans un rack magnétique pendant une minute.
Enfin, transférez le supernatant dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ce protocole a d’abord été exécuté avec des cellules de Jurkat analysant LCK comme cible potentielle de NFAT2. Comme indiqué ici, les résultats optimaux ont été documentés par l’enrichissement significatif du contrôle positif d’IL-2 et de l’ADN de LCK.
Le cisaillement sous-optimal ou la fixation manquante peuvent mener à l’ADN de mauvaise qualité. Enfin, ce protocole a été exécuté avec les cellules humaines primaires de CLL avec CD40L servant de contrôle positif et LCK comme cible expérimentale. Comme en témoigne le fort enrichissement de l’ADN de LCK, le LCK est une cible directe de NFAT2 dans les cellules humaines primaires de CLL.
Un cisaillement inadéquat entraînant une mauvaise qualité de l’ADN peut rapporter des résultats sous-optimaux. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les étapes de fixation et de sonication sont cruciales pour le succès de cette méthode et pourraient devoir être ajustées aux cellules analysées.
