Esse método pode ajudar a fornecer informações-chave no campo da oncologia, como a identificação de genes-alvo putativos e mecanismos patogênicos para desenvolver possíveis intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que se pode detectar a interação de NFAT2 e outros fatores de transcrição com genes de destino conhecidos e novos. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque as condições ideais de fixação e desarquivamento são difíceis de estabelecer.
Para começar a encher um tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 37% de formaldeído. Em seguida, encha outro tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 1,25 molar glycine em um tubo de cinco mililitros com quatro mililitros de PBS. Em seguida, após a estimulação das células giram as células de acordo com o protocolo de texto, e re-suspendem as células em 500 microliters de PBS e colocam o tubo em uma caixa cheia de gelo.
Adicione 13,5 microliters de 37% de formaldeído às células e misture por pipetação para cima e para baixo. Em seguida, incubar a suspensão em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 57 microliters de 1,25 glicina molar para parar a fixação.
E deixe a suspensão incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Imediatamente após o período de incubação, coloque as células no gelo e centrifugar as células a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aspirar o supernaspe.
Em seguida, lave as células duas vezes com um mililitro de PBS gelado a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova o supernante. Resuspense a pelota de célula em cinco mililitros de tampão de lise um por pipetação para cima e para baixo. Em seguida, coloque as amostras no gelo e incuba-as com agitação por 10 minutos.
Depois disso, centrifufique os tubos a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma pipeta para remover cuidadosamente o supernante. Homogeneize as células em cinco mililitros de tampão de lise dois e pipeta para cima e para baixo para misturar.
Em seguida, incubar as células no gelo por 10 minutos com agitação. Após o período de incubação, centrifugar os tubos a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, e remover cuidadosamente o supernasal. Em seguida, resuspende a pelota de célula em tampão de tesoura um com inibidor de protease 1X.
Em seguida, incubar a suspensão celular no gelo por 10 minutos. Transfira 140 microliters da suspensão celular para tubos sonicadores tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. Coloque os tubos em um ultrassônico focado a sete graus Celsius e corte por 10 a 7 e 1/2 minutos.
Transfira a suspensão celular para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar as amostras a 15.700 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, e coletar o supernasal em um novo tubo. Primeiro, prepare 20 microliters de contas revestidas de proteína A para cada precipitação em um tubo de 1,5 mililitro.
Deixe as contas se acomodarem em um rack magnético por um minuto e remova o supernatante. Em seguida, lave as contas com 40 microliters de tampão de chip 1X para cada 20 microliters de proteína revestidas de A por pipetação para cima e para baixo. Deixe as contas se acomodarem em um rack magnético por um minuto e remova o supernatante.
Repita este processo de lavagem mais três vezes antes de suspender as contas em seu volume original de 1X chIP buffer um. Adicione o inibidor de protease BSA, tampão chIP 5X e água de grau ChIP-seq às contas. Em seguida, adicione a cromatina desarmada.
Use 10 microgramas de anticorpo anti-NFAT2 para capturar NFAT2, e 2,5 microgramas de anticorpo IgG como controle. Incubar as misturas durante a noite a quatro graus Celsius em uma roda girando a seis RPM. No dia seguinte gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes G e incuba-os no rack magnético por um minuto.
Em seguida, aspire o supernasciente e lave as contas uma vez com buffers de lavagem um, dois, três e quatro consecutivamente. Gire os tubos por cinco segundos a 7.000 vezes G antes de incubar os tubos no rack magnético por um minuto. Depois disso, remova o supernatante e adicione o próximo tampão de lavagem.
Após a última lavagem, gire os tubos por cinco segundos a 7000 vezes G.Incubar os tubos no rack magnético por um minuto. Remova o supernatante e pegue as contas em 100 microliters de tampão de eluição um. Em seguida, incubar os tubos na roda giratória por 30 minutos.
Em seguida, gire brevemente os tubos e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione quatro microliters de tampão de eluição dois. Para criar o controle de entrada misture um microliter da cromatina desarmada com 99 microliters de tampão de elução um e quatro microliters de tampão de elução dois.
Em seguida, incubar as amostras por quatro horas a 65 graus Celsius com agitação. Depois disso, adicione 100 microlitadores de 100% isopropanol aos tubos. Vórtice e gire as amostras por cinco segundos a 7000 vezes G., adicione 10 microliters de contas magnéticas a cada amostra.
Vórtice e incubar as amostras em uma roda giratória à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, gire os tubos brevemente e coloque-os em um rack magnético por um minuto. Aspire o supernascer e resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lavagem um.
Inverta os tubos para misturá-los e incubar-nos por cinco minutos em uma roda giratória à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar brevemente os tubos. Coloque-os em um rack magnético por um minuto e use uma pipeta para remover o supernatante.
Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de lavagem dois. Inverta os tubos para misturá-los e incubar-nos por cinco minutos em uma roda giratória à temperatura ambiente. Depois disso, centrifufique brevemente os tubos e coloque-os em um rack magnético por um minuto.
Remova o tampão de lavagem dois via aspiração e resuspenja as contas em 55 microliters de tampão de eluição. Para eluto o DNA precipitado incubar as amostras em uma roda giratória à temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, gire os tubos brevemente e coloque-os em um rack magnético por um minuto.
Finalmente, transfira o supernatante para novos tubos de 1,5 mililitro. Este protocolo foi realizado pela primeira vez com células Jurkat analisando LCK como um potencial alvo NFAT2. Como mostrado aqui, os resultados ideais foram documentados pelo enriquecimento significativo do controle positivo il-2 e do DNA LCK.
A tesoura subótima ou a falta de fixação podem levar a DNA de má qualidade. Finalmente, este protocolo foi realizado com células CLL humanas primárias com CD40L servindo como o controle positivo e LCK como alvo experimental. Como demonstrado pelo forte enriquecimento do DNA LCK, lCK é um alvo NFAT2 direto em células CLL humanas primárias.
A tesoura inadequada que resulta em DNA de má qualidade pode retornar resultados subótimos. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que as etapas de fixação e sônica são cruciais para o sucesso deste método e podem ter que ser ajustadas às células que estão sendo analisadas.
