שיטה זו יכולה לסייע לספק מידע מרכזי בתחום האונקולוגיה כגון זיהוי גנים של מטרות פתוגניים ומנגנונים פתוגניים לפיתוח התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות את האינטראקציה של NFAT2 וגורמי שעתוק אחרים עם גנים יעד ידועים ורומן. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי קיבעון אופטימלי ותנאי גיהה קשה לקבוע.
כדי להתחיל למלא צינור 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 37% פורמלדהיד. ואז למלא עוד צינור 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 1.25 גליצין טוחן בצינור חמישה מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, לאחר גירוי התאים לסובב את התאים על פי פרוטוקול הטקסט, ולהשעות מחדש את התאים ב 500 microliters של PBS ולמקם את הצינור בתיבה מלאה בקרח.
הוסיפו 13.5 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד לתאים וערבבו על ידי צינור למעלה ולמטה. ואז לה הדגירה ההשעיה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 57 microliters של 1.25 גליצין טוחן כדי לעצור את הקיבעון.
ולאפשר להשעיה דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מיד לאחר תקופת הדגירה מניחים את התאים על קרח וצנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. אז שאף את העל-טבעי.
לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את על טבעי. תן מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של חיץ תזה אחד על ידי צינור למעלה ולמטה. ואז לשים את הדגימות על קרח דגירה אותם עם רועד במשך 10 דקות.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש פיפטה כדי להסיר בזהירות את על טבעי. הומוגניזציה של התאים בחמישה מיליליטר של מאגר תמוגה 2 ו pipette למעלה ולמטה לערבב.
ואז להחגירה את התאים על קרח במשך 10 דקות עם רעידות. לאחר תקופת הדגירה צנטריפוגה הצינורות ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, בזהירות להסיר את העל טבעי. לאחר מכן, לחץ מחדש את גלולת התא במאגר גיזום אחד עם מעכב פרוטאז 1X.
ואז להחגירה את ההשעיה התא על קרח במשך 10 דקות. להעביר 140 microliters של ההשעיה התא צינורות sonicator דואג להימנע יצירת בועות אוויר. מניחים את הצינורות באולטרסאונד ממוקד בשבע מעלות צלזיוס ומצרפים במשך 10 עד 7 ו 1/2 דקות.
העבר את ההשעיה התא לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הדגימות ב 15, 700 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף את supernatant בצינור חדש. ראשית, להכין 20 microliters של חלבון מצופה חרוזים עבור כל משקעים בצינור אחד 1.5 מיליליטר.
אפשרו לחטרוזים להתיישב על מתלה מגנטי למשך דקה אחת, ולהסיר את העל-טבעי. לאחר מכן לשטוף את חרוזים עם 40 microliters של חיץ שבב 1X אחד עבור כל 20 microliters של חלבון מצופה חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה. אפשרו לחטרוזים להתיישב על מתלה מגנטי למשך דקה אחת ולהסיר את העל-טבעי.
חזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים נוספות לפני השעייתם מחדש של חרוזים באמצעי האחסון המקורי שלהם של מאגר 1X chIP אחד. הוסף מעכב פרוטאז BSA, חיץ chIP 5X, ומים כיתה ChIP-seq ל חרוזים. לאחר מכן, מוסיפים את הכרומטין המוגזם.
השתמש 10 מיקרוגרם של נוגדן נגד NFAT2 כדי ללכוד NFAT2, ו 2.5 מיקרוגרם של נוגדן IgG כבקרה. הדגירה את תערובות לילה בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב בשש סל"ד. למחרת לסובב את הצינורות במשך חמש שניות ב 7, 000 פעמים G ולהדק אותם על המדף המגנטי במשך דקה אחת.
ואז לשאפת את supernatant ולשטוף את חרוזים פעם אחת עם מאגרי לשטוף אחד, שתיים, שלוש, וארבע ברציפות. לסובב את הצינורות במשך חמש שניות ב 7000 פעמים G לפני דגירה הצינורות על המדף המגנטי במשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי והוסף את מאגר הכביסה הבא.
לאחר הכביסה האחרונה, לסובב את הצינורות במשך חמש שניות ב 7000 פעמים G.Incubate הצינורות על המדף המגנטי במשך דקה אחת. הסר את supernatant ולקחת את חרוזים ב 100 microliters של מאגר אלוטיון אחד. ואז לה הדגירה את הצינורות על הגלגל המסתובב במשך 30 דקות.
לאחר מכן, סובבו לזמן קצר את הצינורות וה מניחים אותם על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון 2. כדי ליצור את בקרת הקלט מערבבים מיקרוליטר אחד של הכרומטין המוטה עם 99 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון אחד וארבעה מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון 2.
ואז להדגר את הדגימות במשך ארבע שעות ב 65 מעלות צלזיוס עם רעידות. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של 100% isopropanol לצינורות. Vortex ולסובב את הדגימות במשך חמש שניות ב 7000 פעמים G.Then להוסיף 10 microliters של חרוזים מגנטיים לכל מדגם.
מערבולת ולהדגור את הדגימות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, לסובב את הצינורות לזמן קצר ולה מניח אותם על מתלה מגנטי במשך דקה אחת. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את חרוזיו ב-100 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה אחד.
להפוך את הצינורות לערבב ולהדרגר אותם במשך חמש דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לזמן קצר צנטריפוגה הצינורות. מניחים אותם בארון מגנטי למשך דקה אחת, ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את supernatant.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה 2. להפוך את הצינורות לערבב ולהדרגר אותם במשך חמש דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לזמן קצר צנטריפוגה הצינורות למקם אותם במתלה מגנטי במשך דקה אחת.
הסר את חיץ הכביסה 2 באמצעות שאיפה ולחץ מחדש את חרוזים ב 55 microliters של חיץ אלוטיון. כדי לשאוב את הדנ"א המזרז דגירה את הדגימות בגלגל מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, לסובב את הצינורות בקצרה ולה למקם אותם במתלה מגנטי במשך דקה אחת.
לבסוף, להעביר את supernatant לצינורות חדשים 1.5 מיליליטר. פרוטוקול זה בוצע לראשונה עם תאי Jurkat המנתחים את LCK כיעד NFAT2 פוטנציאלי. כפי שמוצג כאן, תוצאות אופטימליות תועדו על ידי העשרה משמעותית של השליטה החיובית IL-2 ו- LCK DNA.
גיהום תת אופטימלי או קיבעון חסר עלול להוביל לדנ"א באיכות ירודה. לבסוף, פרוטוקול זה בוצע עם תאי CLL אנושיים ראשוניים עם CD40L המשמשים כבקרה חיובית ו- LCK כיעד ניסיוני. כפי שהוכח על ידי העשרה חזקה של ה-DNA LCK, LCK הוא יעד NFAT2 ישיר בתאי CLL אנושיים ראשוניים.
גיה לא מספקת וכתוצאה מכך דנ"א באיכות ירודה יכול להחזיר תוצאות תת-אופטימליות. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי שלבי הקיבעון וההסוניקציה חיוניים להצלחת שיטה זו וייתכן שיהיה צריך להתאים אותם לתאים המנותחים.
