Este protocolo es útil para determinar los cambios en la activación de NF-kappa-B en las células que expresan un reportero de luciferasa NF-kappa-B. La principal ventaja de esta técnica es que permite una pantalla de alto rendimiento de factores o condiciones que conducen a cambios en la activación NF-kappa-B. NF-kappa-B es un factor de transcripción para una amplia variedad de procesos celulares.
Una función bien conocida de NF-kappa-B es en la inducción de respuestas inflamatorias mediante la inducción de la expresión de varias citoquinas y quimioquinas. Nuestro laboratorio está particularmente interesado en la inducción de NF-kappa-B inducida por el patógeno Salmonella typhimurium. Aquí, usamos la línea celular HeLa que se transfecta establemente con un plásmido reportero de NF-kappa-B luciferase.
Otras bacterias, o incluso virus o compuestos químicos, se pueden utilizar en esta línea celular para estudiar la activación de NF-kappa-B. También se pueden utilizar otras líneas celulares si puede introducir un plásmido reportero de NF-kappa-B luciferase en esa línea celular. Alguien que hace esto por primera vez puede tener problemas correctamente utilizando la técnica estéril que se requiere para el cultivo celular y el trabajo bacteriano.
Un día antes de la estimulación celular, eliminar los medios de crecimiento de las células de HeLa 57A que se han cultivado a aproximadamente 75%confluencia. Lavar las células con un mililitro de 0,05% de trippsina EDTA. Reemplace con otro mililitro de trippsina EDTA y transfiera el matraz a una incubadora de 37 grados Celsius durante cinco minutos.
Después de que las células se hayan separado del matraz, suspendalas en 10 mililitros de medios de crecimiento. Combine 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de color azul Trypan, pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transfiera 10 microlitros a un portaobjetos de celda. Recuento de células en suspensión utilizando un contador celular, y utilice medios de crecimiento para diluir las células a una concentración final de 2,5 veces 10 a las cinco células por mililitro en un tubo cónico de 50 mililitros.
Transfiera 250 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de 48 pozos. Tapar y girar periódicamente el tubo cónico para asegurar una suspensión celular homogénea. Toque suavemente la placa en el lateral para asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente en los pozos.
Transfiera la placa a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono del 5% y permita que las células se adhieran y crezcan durante la noche. Raya las existencias congeladas de Salmonella sobre los platos de agar LB para producir colonias individuales. Transfiera las placas a una incubadora de 37 grados centígrados y permita el crecimiento durante la noche.
Al día siguiente, añadir tres mililitros de LB a tubos de cultivo bacterianos estériles, y añadir antibióticos apropiados a los medios. Usando un bucle de inoculación estéril, elija una sola colonia de los cultivos bacterianos rayados y toque el lazo a los medios LB. Tapa los tubos después de inocular y deseche el lazo.
Coloque los tubos en una incubadora de temblores en 37 grados Celsius y 180 RPM, luego permita que las bacterias crezcan durante la noche. Por la mañana, recuperar cultivos bacterianos durante la noche de la incubadora. Preparar tubos para la subcultura mediante la adición de tres mililitros de LB fresco y antibióticos.
Transfiera 30 microlitros del cultivo bacteriano nocturno a los medios recién preparados. Coloque los tubos en una incubadora de temblores a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de las tres horas de incubación, transfiera un mililitro de caldo LB estéril a una cubeta de plástico para servir como blanco.
Transfiera 900 microlitros de LB a las otras cubetas que se utilizarán para el análisis de la muestra. Transfiera 100 microlitros de subcultura bacteriana a una cubeta que contenga 900 microlitros de LB, y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Repita esto para cada suspensión bacteriana.
Encienda el espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos bacterianos a una longitud de onda de 600 nanómetros. Coloque el espacio en blanco en el espectrofotómetro. Tome nota de la orientación.
Cierre la tapa y pulse el botón en blanco del espectrofotómetro para obtener la absorción de fondo. Sustituya la cubeta en blanco por una cubeta de muestra en la misma orientación y pulse leer. Registre los valores OD600 de estos ejemplos.
Multiplique el valor por 10 para tener en cuenta el factor de dilución. Diluir la suspensión de uno a 10 en una cubeta y medir la absorbancia, lo que debe dar un valor de aproximadamente 0,1 que corresponde aproximadamente a uno por 10 a la nueve UFC por mililitro. En un tubo nuevo, añadir un volumen adecuado de la subcultura diluida a LB fresco para lograr una suspensión de uno por 10 a las ocho UFC por mililitro que se utilizará como inóculo.
Preparar diluciones en serie del inóculo transfiriendo 50 microlitros de suspensión bacteriana a un tubo que contiene 450 microlitros de PBS estéril hasta que se realice una dilución final de aproximadamente 100 UFC por mililitro. Transfiera 100 microlitros de las dos diluciones más bajas, 100 y 1000 UFC por mililitro, a dos placas de agar LB, y esparza la suspensión con un esparcidor celular para obtener colonias individuales. Transfiera estas placas a una incubadora de 37 grados Celsius e incubar durante la noche.
Al día siguiente, contar las colonias y calcular la concentración bacteriana del inóculo inicial para determinar la concentración real de inóculo. El mismo día, etiquetar la tapa de la placa de acuerdo con las condiciones de infección que se utilizarán para cada pozo, con cada condición se realiza en triplicado. Agregue 10 microlitros del inóculo a los pozos apropiados, y agregue 10 microlitros de LB estériles a los pozos de control no infectados.
Para sincronizar la hora de la infección, coloque la placa en una centrífuga de mesa y gire a 500 veces G durante cinco minutos, asegurándose de que la placa esté contrarrestada. Luego, transfiera las células infectadas a una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante una hora. Coloque un tubo cónico de 15 mililitros que contenga una alícuota de medios de cultivo celular en un baño de agua de 37 grados Celsius para su uso en el siguiente paso.
Una hora después del momento de la infección, retire el tubo cónico de 15 mililitros que contiene medios de cultivo celular del baño de agua y limpie el exterior con 70% de etanol. Transfiera las placas de cultivo de tejido de la incubadora a un gabinete de bioseguridad. Utilice puntas estériles para aspirar medios de los pozos y reemplazarlos con 250 microlitros de medios de cultivo celular frescos y cálidos.
Devuelva las placas a la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante cuatro horas adicionales. Después de eso, retire las placas de la incubadora de dióxido de carbono y aspire los medios de los pozos. Para el análisis de la lucifera, agregue 100 microlitros de tampón de lisis de 1X celular a los pozos.
Transfiera la placa a un congelador negativo de 80 grados Celsius e incubar durante al menos 30 minutos para garantizar una lelisis celular eficiente. A continuación, coloque la placa que contiene el lisolato de celda congelada en un banco para descongelar, y prepare los reactivos de sustrato de luciferasa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Permita que los reactivos de sustrato de luciferasa se equilibren a temperatura ambiente.
A continuación, encienda el lector de placas y abra el programa de lectura correspondiente. Ajuste la máquina para medir la luminiscencia. Transfiera 10 microlitros de cada celda de lito a un pozo de una placa opaca de 96 pozos.
Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros del reactivo de ensayo de luciferasa a cada pozo de la placa opaca. Toque suavemente la placa en el lado para mezclar los pozos, y asegúrese de que la superficie inferior esté cubierta de líquido. Coloque la placa en un lector de placas e inicie la lectura.
Copie los valores de luminiscencia en un programa de hoja de cálculo y trace los resultados. Este protocolo se centra en la activación del factor de transcripción NF-kappa-B utilizando un reportero luciferasa dependiente de NF-kappa-B que se transfecta establemente en una línea de células HeLa. Esta figura muestra un experimento representativo de activación de luciferasa dependiente de NF-kappa-B y expresión génica IL6 en células HeLA 57A infectadas con las cepas de Salmonella typhimurium.
La infección con la cepa wild type SL1344 indujo una fuerte señal de luciferasa tanto en la expresión RLU como en la EXPRESión IL6, que disminuyó en las células infectadas con el mutante triple sipA sopB sopE2 y se redujo a niveles de control con el mutante cuádruple sopE sopE2 de sipA sopB. Preste mucha atención al hacer sus diluciones en serie y chapado. Esto asegurará que usted tenga un inóculo consistente en todas sus cepas.
Después de identificar los factores que contribuyen a la activación de NF-kappa-B y los cambios posteriores en la expresión de ARNm, la técnica de manchas occidentales se puede utilizar para identificar cambios en la expresión de proteínas. Este protocolo ha permitido a nuestro laboratorio no sólo evaluar la activación NF-kappa-B inducida por Salmonella, sino también otros compuestos y proteínas implicados en la activación de NF-kappa-B. Salmonella typhimurium es un patógeno humano.
Emplear EPP adecuado cuando se trabaja con estas bacterias.
