Этот метод может помочь предоставить ключевую информацию в области онкологии, такие как выявление целевых генов и патогенных механизмов для разработки потенциальных терапевтических вмешательств. Основным преимуществом этого метода является то, что можно обнаружить взаимодействие NFAT2 и других транскрипционных факторов с известными и новыми генами-мишени. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что оптимальная фиксация и стрижка условия трудно установить.
Для начала заполните 1,5-миллилитровую трубку одним миллилитром 37%формальдегида. Затем заполните еще 1,5-миллилитровую трубку одним миллилитром 1,25 моларглицина в пятими миллилитровой трубке с четырьмя миллилитров PBS. Далее, после стимуляции клеток спина клеток в соответствии с текстовым протоколом, и повторно приостановить клетки в 500 микролитров PBS и поместить трубку в заполненной льдом коробке.
Добавьте 13,5 микролитров 37%формальдегида в клетки и смешайте с помощью трубок вверх и вниз. Затем инкубировать подвеску при комнатной температуре. После этого добавьте 57 микролитров 1,25 молярного глицина, чтобы остановить фиксацию.
И дайте подвеске инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Сразу же после инкубационный период поместите клетки на лед и центрифугу клеток в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах цельсия. Затем аспирировать супернатанта.
Затем, мыть клетки дважды с одним миллилитр ледяной PBS при 200 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и удалить супернатант. Resuspend гранулы клетки в 5 миллилитров буфера лиза одного pipetting вверх и вниз. Затем положить образцы на лед и инкубировать их тряской в течение 10 минут.
После этого центрифуга труб при 500 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем используйте пипетку, чтобы тщательно удалить супернатант. Гомогенизировать клетки в пяти миллилитров лиза буфера два и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.
Затем инкубировать клетки на льду в течение 10 минут с встряхивания. После инкубационный период центрифуга трубки при 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах цельсия, и тщательно удалить супернатант. Далее, повторное использование клеточных гранул в стрижке буфера с ингибитором 1X протеазы.
Затем инкубировать подвеску клетки на льду в течение 10 минут. Передача 140 микролитров клеточной подвески в sonicator трубки, заботясь, чтобы избежать формирования пузырьков воздуха. Поместите трубки в сфокусированный ультразвуковой аппарат при семи градусах по Цельсию и скоут в течение 10-7 и 1/2 минут.
Перенесите подвесную клетку в 1,5-миллилитровые трубки. Центрифуга образцов на 15, 700 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, и собирать супернатант в новой трубке. Во-первых, подготовить 20 микролитров белка С покрытием бисера для каждого осадка в одной 1,5-миллилитровой трубки.
Разрешить бисер поселиться на магнитной стойке в течение одной минуты, и удалить супернатант. Затем мыть бисер с 40 микролитров 1X чип буфера по одному на каждые 20 микролитров белка-покрытые бисером путем трубопроводов вверх и вниз. Позвольте бисеру поселиться на магнитной стойке в течение одной минуты и удалить супернатант.
Повторите этот процесс стирки еще три раза, прежде чем повторно приостановить бисер в их первоначальном объеме 1X chIP буфер один. Добавьте в бисер ингибитор протеазы BSA, буфер 5X chIP и воду класса ChIP-seq. Далее добавьте сноф chromatin.
Используйте 10 микрограммов антител против NFAT2 для захвата NFAT2 и 2,5 микрограмма антител IgG в качестве контроля. Инкубировать смеси на ночь при четырех градусах по Цельсию на колесе, вращающемся при шести об/мин. На следующий день вращайте трубки в течение пяти секунд при 7000 раз G и инкубировать их на магнитной стойке в течение одной минуты.
Затем аспирировать супернатант и мыть бисер один раз с мыть буферов один, два, три и четыре последовательно. Спин трубки в течение пяти секунд на 7000 раз G до инкубации труб на магнитной стойке в течение одной минуты. После этого снимите супернатант и добавьте следующий буфер стирки.
После последней стирки, спина трубки в течение пяти секунд в 7000 раз G.Incubate труб на магнитной стойке в течение одной минуты. Удалите супернатант и возьмите бисер в 100 микролитров элюционного буфера. Затем инкубировать трубки на вращающемся колесе в течение 30 минут.
Далее, кратко спина труб и поместить их на магнитной стойке в течение одной минуты. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и добавьте четыре микролитров буфера elution два. Для создания управления входом смешайте один микролитер с стрижкой хроматина с 99 микролитров буфера элюции один и четыре микролитера элюционного буфера два.
Затем инкубировать образцы в течение четырех часов при 65 градусах по Цельсию со тряской. После этого добавьте в трубки 100 микролитров 100%изопропанола. Vortex и спина образцов в течение пяти секунд в 7000 раз G.Then добавить 10 микролитров магнитных бусин для каждого образца.
Vortex и инкубировать образцы на вращающемся колесе при комнатной температуре в течение часа. Затем коротко закрути трубы и поместите их на магнитную стойку на одну минуту. Аспирировать супернатант и повторно помыть бисер в 100 микролитров мыть буфера один.
Переверните трубки, чтобы смешать и инкубировать их в течение пяти минут на вращающемся колесе при комнатной температуре. Далее, кратко центрифуга труб. Поместите их в магнитную стойку на одну минуту, и использовать пипетку, чтобы удалить супернатант.
Затем добавьте 100 микролитров буфера мытья два. Переверните трубки, чтобы смешать и инкубировать их в течение пяти минут на вращающемся колесе при комнатной температуре. После этого кратко центрифуга труб и поместите их в магнитной стойке в течение одной минуты.
Удалите буфер мытья два через аспирации и повторно бусинки в 55 микролитров элюционного буфера. Чтобы узнать осаждаемую ДНК, инкубируют образцы в вращающемся колесе при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого, спина трубки кратко и поместить их в магнитной стойке в течение одной минуты.
Наконец, перенесите супернатант на новые 1,5-миллилитровые трубки. Этот протокол был впервые выполнен с jurkat клетки анализа LCK в качестве потенциальной цели NFAT2. Как показано здесь, оптимальные результаты были задокументированы значительным обогащением положительного контроля Ил-2 и ДНК LCK.
Неоптимальные стрижки или отсутствует фиксация может привести к плохому качеству ДНК. Наконец, этот протокол был выполнен с первичными клетками CLL человека с CD40L, выступающей в качестве положительного контроля и LCK в качестве экспериментальной цели. Как показало сильное обогащение ДНК LCK, LCK является прямой целью NFAT2 в первичных клетках ХЛЛ человека.
Неадекватный стрижка, приводящая к плохому качеству ДНК, может привести к неоптимальным результатам. При попытке этой процедуры важно помнить, что шаги фиксации и звуковой связи имеют решающее значение для успеха этого метода и, возможно, должны быть скорректированы на анализируемые клетки.
